一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111662944A(43)申请公布日2020.09.15(21)申请号201910164725.7C12R1/84(2006.01)(22)申请日2019.03.05(71)申请人上海医药工业研究院地址200040上海市静安区北京西路1320号申请人中国医药工业研究总院(72)发明人谢丽萍胡又佳朱文吴珺艺阮江雄韩姝徐磊(74)专利代理机构上海弼兴律师事务所31283代理人薛琦王卫彬(51)Int.Cl.C12P21/02(2006.01)C12N15/81(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K1/22(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表2页附图11页(54)发明名称一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法(57)摘要本发明提供了一种人血清白蛋白的制备方法，其包括将产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌接种于培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可；所述培养基为除了甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均至多降低为1/4的BSM培养基，优选降低为1/4～1/2的BSM培养基。本发明还提供了一种人血清白蛋白的纯化方法。利用本发明的制备方法制得的人血清白蛋白的产量及其占总蛋白的比例均显著高于现有技术，且该制备方法中所使用的培养基成本显著降低，且无动物源性病毒污染的风险，从而显著降低制备方法的成本。利用本发明所述的纯化方法纯化的回收率显著提升，并且最终产品的纯度也显著进一步提升。CN111662944ACN111662944A权利要求书1/2页1.一种人血清白蛋白的制备方法，其特征在于，其包括将产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌(Pichiapastoris)接种于培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可；其中，所述培养基为除了甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均至多降低为1/4的BSM培养基，优选降低为1/4～1/2的BSM培养基。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述降低为1/2的BSM培养基包括4％甘油、1.335％磷酸、0.0465％二水合硫酸钙、0.91％硫酸钾、0.745％七水合硫酸镁、0.206％氢氧化钾和0.4％毕赤酵母微量元素1；所述降低为1/4的BSM培养基包括4％甘油、0.6675％磷酸、0.02325％二水合硫酸钙、0.455％硫酸钾、0.3725％七水合硫酸镁、0.103％氢氧化钾和0.4％毕赤酵母微量元素1；其中，所述磷酸和所述毕赤酵母微量元素1的百分比为各组分占所述培养基的体积百分比；其余组分的百分比为各组分占所述培养基的质量体积百分比。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母微量元素1包括0.6％五水合硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％一水合硫酸锰、0.02％二水和钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％七水合硫酸亚铁、0.02％生物素和0.5％硫酸；其中，所述硫酸的百分比为其占所述毕赤酵母微量元素1的体积百分比；其余组分的百分比为各组分占所述毕赤酵母微量元素1的质量体积百分比。4.如权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌是在巴斯德毕赤酵母菌中整合有人血清白蛋白基因的表达载体的工程菌，所述的表达载体依次含有启动子、α引导肽、人血清白蛋白基因和终止子；较佳地：所述的启动子为AOX1启动子；和/或，所述的α引导肽来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；和/或，所述的表达载体带有抗遗传霉素基因，所述的基因工程菌具有抗0.25～5.0mg/mL浓度的遗传霉素的性能；和/或，所述的人血清白蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示；和/或，所述的表达载体的骨架为质粒pPIC9K。5.一种除甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均降低为1/4的BSM培养基或降低为1/2的BSM培养基在生物发酵制备人血清白蛋白中的应用；较佳地，所述的降低为1/4的BSM培养基或降低为1/2的BSM培养基为如权利要求2或3中所述的降低为1/4的BSM培养基或降低为1/2的BSM培养基，和/或，所述生物发酵为利用如权利要求4中所述的产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌进行发酵。6.一种人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括将人血清白蛋白进行亲和层析的步骤，所述亲和层析时所用的上样缓冲液为7＞pH≥4.3，优选为pH≥5；所述人血清白蛋白为通过发酵产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌得到的人血清白蛋白。7.如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法还包括将人血清白蛋白进行疏水层析和第二次亲和层析的步骤。8.如权利要求6或7所述的纯化方法，其特