用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111741770A(43)申请公布日2020.10.02(21)申请号201880089651.9(74)专利代理机构北京市中咨律师事务所(22)申请日2018.12.2811247代理人张建黄革生(30)优先权数据17211124.72017.12.29EP(51)Int.Cl.A61K47/60(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C07K1/18(2006.01)2020.08.18C07K1/20(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据C07K14/505(2006.01)PCT/EP2018/0971222018.12.28(87)PCT国际申请的公布数据WO2019/129876EN2019.07.04(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人W·克恩莱因权利要求书2页说明书54页序列表3页附图14页(54)发明名称用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法(57)摘要提供了用于提供包含单‑聚乙二醇化蛋白质和寡‑聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质组合物的方法，并且提供了用于提供具有高收率和产率的单‑聚乙二醇化蛋白质组合物的方法。所述的方法特别适合于提供单‑聚乙二醇化红细胞生成素组合物。这些方法包含使非‑聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非‑聚乙二醇化、单‑聚乙二醇化和寡‑聚乙二醇化蛋白质的混合物，使该混合物经历阴离子交换色谱步骤，并且将非‑聚乙二醇化蛋白质再循环入进一步的聚乙二醇化反应。CN111741770ACN111741770A权利要求书1/2页1.用于生产聚乙二醇化蛋白质混合物的方法，该方法包含：a)使非-聚乙二醇化蛋白质与聚乙二醇化试剂反应，产生包含非-聚乙二醇化蛋白质和聚乙二醇化蛋白质的反应产物混合物，其中聚乙二醇化蛋白质包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质；b)使反应产物的混合物经历离子交换色谱(IEC)步骤，得到IEC流通溶液，其中聚乙二醇化蛋白质的级分相对于反应产物的混合物增加；IEC步骤包含将反应产物的混合物在适合于结合非-聚乙二醇化蛋白质的条件下施加于IEC材料；和c)从步骤b)中收集IEC流通溶液，得到包含单-聚乙二醇化蛋白质和寡-聚乙二醇化蛋白质的聚乙二醇化蛋白质混合物，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。2.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质为激素、细胞因子、酶或抗体。3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述蛋白质为红细胞生成素。4.根据上述权利要求任一项的方法，其中IEC步骤为阴离子交换(AEC)步骤。5.根据上述权利要求任一项的方法，其中进行步骤a)、b)和c)的两个或多个循环，其中通过从IEC材料中洗脱IEC洗脱液在步骤b)中回收非-聚乙二醇化蛋白质，并且将洗脱的非-聚乙二醇化蛋白质用于随后的聚乙二醇化反应。6.根据权利要求5的方法，其中该方法包含3、4或5个循环，其中在每个循环的步骤b)中，回收非-聚乙二醇化蛋白质并且用于随后的聚乙二醇化反应。7.根据权利要求5或权利要求6的方法，其中步骤c)还包含汇集从每个IEC步骤中收集的流通溶液，得到聚乙二醇化蛋白质混合物，其为汇集的聚乙二醇化蛋白质混合物。8.根据上述权利要求任一项的方法，其中从IEC材料中洗脱非-聚乙二醇化蛋白质使用包含小于或等于约45mM盐的洗脱缓冲液。9.根据上述权利要求任一项的方法，其中将步骤b)IEC的洗脱液直接添加到随后的聚乙二醇化反应中。10.根据上述权利要求任一项的方法，其中回收非-聚乙二醇化蛋白质并且用于随后的聚乙二醇化反应，并且，其中还将新鲜的非-聚乙二醇化蛋白质加入到随后的聚乙二醇化反应中，以便在每次聚乙二醇化反应维持基本上恒定的聚乙二醇化反应条件。11.根据上述权利要求任一项的方法，其中IEC材料具有低于约1.5g/L的聚乙二醇化蛋白质的结合容量。12.根据上述权利要求任一项的方法，其中：i.反应产物的混合物包含低于25％的寡-聚乙二醇化蛋白质；和/或ii.IEC流通溶液包含至少90％的聚乙二醇化蛋白质。13.根据上述权利要求任一项的方法，其中IEC步骤为AEC步骤，并且其中i.AEC材料为ToyopearlSuperQ650M；和/或ii.AEC步骤在约7.0-9.0的pH下进行；和/或iii.AEC步骤在约1.0-3.0mS/cm的电导率下进行；和/或iv.将反应产物的混合物施加于AEC材料作为包含约10-30mMN，N-二(羟乙基)甘氨酸2CN111741770A权利要求书2/2页和约1-10mMNa2SO4的AEC负载溶液。14.根据上述权利要求任