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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111751468A(43)申请公布日2020.10.09(21)申请号202010636434.6G01N30/74(2006.01)(22)申请日2020.07.03(71)申请人上海艾魁英生物科技有限公司地址201612上海市松江区新桥镇新庙三路781号1层(72)发明人黄易明周新文黄润超刘翠尹翠凤(74)专利代理机构上海上大专利事务所(普通合伙)31205代理人顾勇华(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/16(2006.01)G01N30/72(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法(57)摘要本发明公开了一种溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,对交联后得到的溶菌酶单体/多聚体混合物,采用高效液相系统进行体积排阻色谱分离纯化。色谱柱为亲水硅胶柱;流动相为50mMPB,尿素0.5M,硫酸铵0.3M,乙腈10%;以0.35ml/min的流速驱动,样品的分析时间设置为40分钟;使用UV280nm紫外检测器进行检测。对混合物中二聚体馏分进行收集,冷冻干燥后采用超滤管进行脱盐处理。得到的溶菌酶二聚体水溶液采用BCA定量试剂盒进行浓度测定,按照分装后冻干,得到溶菌酶二聚体标准品。本发明方法过程在室温下5小时即可完成,工艺步骤简单、操作简易可行,溶菌酶二聚体收率高,成本低,效果好。CN111751468ACN111751468A权利要求书1/1页1.一种溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,其特征在于,包括如下步骤:a.取交联后得到的溶菌酶单体和多聚体混合物,采用高速离心机进行离心处理,以去除不溶解的杂质,取上清液分装到色谱进样瓶中,备用;b.采用高效液相系统,对在所述步骤a中得到的上清液进行体积排阻色谱分离纯化处理,得到分离纯化的溶菌酶二聚体的混合物;在进行分离纯化过程中,采用的色谱柱为亲水硅胶柱,流动相的流速设定为0.35ml/min,分析时间设置为40分钟,采用UV280nm紫外检测器进行检测;进行分离纯化时,将得到的在所述步骤a中得到的上清液中的二聚体馏分进行收集,经冷冻干燥后,采用超滤管进行脱盐处理,将得到的溶菌酶二聚体水溶液采用BCA定量试剂盒进行浓度测定,然后按照100微克/管进行分装后再进行冻干,得到纯度不低于99%的溶菌酶二聚体标准品。2.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,其特征在于:在所述步骤a中,进行离心处理时,设置离心力不低于15000g,离心处理至少10分钟。3.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,其特征在于:在所述步骤b中,所采用的亲水硅胶柱参数如下:7.8*300ID,5μm。4.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,其特征在于:在所述步骤b中,所采用的流动相中,PB的浓度为50mM,尿素的浓度为0.5M,硫酸铵的浓度为0.3M,乙腈的体积浓度为10%(v/v.)。5.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,其特征是:在所述步骤b中,调节所采用的流动相的pH为3。6.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,其特征在于:在所述步骤b中,所使用的化学试剂为分析纯,溶液为色谱纯。7.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,其特征是:在所述步骤b中,所述超滤管采用截流分子量不大于14KD的超滤离心管。8.根据权利要求7所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,其特征是:在所述步骤b中,所述超滤管采用截流分子量不大于3KD的超滤离心管。9.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,其特征是:在所述步骤b中,将超滤管的超滤离心转速设置不低于8000rpm,分为至少6次加入色谱纯水进行溶液置换,并分别离心处理,每次离心不少于20分钟。10.根据权利要求1所述溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法,其特征是:在所述步骤b中,采用MALDI-TOF质谱仪和SDS-PAGE凝胶分离进行检测,得知溶菌酶二聚体纯度。2CN111751468A说明书1/4页溶菌酶二聚体的纯化及其标准品制备的方法技术领域[0001]本发明涉及一种二聚体的纯化制备的方法,特别是涉及一种溶菌酶二聚体的分离纯化制备的方法,应用于化学物质分离纯化和试验标准品制备技术领域。背景技术[0002]溶菌酶是自然界常见的一种球状碱性蛋白,其分子量MW约为14.4kDa,具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶二聚体是以蛋清溶菌酶为原料,将单体溶菌酶改性为溶菌酶二聚体,该二聚体保留了单体溶菌酶的酶活性,而且还具有相当新的