杜仲多糖指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112362776A(43)申请公布日2021.02.12(21)申请号202011207313.6G01N30/86(2006.01)(22)申请日2020.11.03(71)申请人西南民族大学地址610041四川省成都市武侯区一环路南四段16号(72)发明人柏雪张登辉(74)专利代理机构成都正华专利代理事务所(普通合伙)51229代理人李蕊(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/34(2006.01)G01N30/36(2006.01)G01N30/74(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图3页(54)发明名称杜仲多糖指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱(57)摘要本发明公开了一种杜仲多糖指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，构建方法包括以下步骤：(1)杜仲多糖的提取；(2)杜仲多糖样品衍生化；(3)多糖含量测定；(4)指纹图谱的建立。本发明选取天然植物杜仲为原料，采用水提‑醇沉法对多糖进行提取，利用PMP柱前衍生HPLC法建立杜仲多糖的指纹图谱，具有操作简单、稳定、灵敏、精密度高、重现性好、回收率好等优点，从整体特征面貌上把握杜仲多糖质量情况，为杜仲质量控制和真伪鉴别提供了新的科学方法。CN112362776ACN112362776A权利要求书1/2页1.一种杜仲多糖指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)杜仲多糖的提取将杜仲叶、皮粉碎，过筛，加入石油醚，60-80℃回流脱脂4-6h；然后加水，100℃浸提4-6h，重复一次，合并水提液，过滤，浓缩；然后向浓缩液中加入三氯乙酸溶液，4℃下静置10-15h，离心，取上清液，加入无水乙醇，4℃下静置10-15h，再离心，取沉淀，洗涤，干燥，得到杜仲粗多糖；(2)杜仲多糖样品衍生化向杜仲粗多糖中加入三氟乙酸，氮气封口后100-120℃水解4-6h，旋干，洗涤，再旋干，重复3次，加水得到水解液；向水解液中加入NaOH溶液和PMP甲醇溶液，在60-80℃水浴反应80-120min，冷却后加入HCl溶液，再加入氯仿萃取，取上层液，重复3次，离心，收集上清，过滤，得待测品；(3)指纹图谱的建立采用HPLC法测定色谱图，色谱条件为色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C18，柱温：35℃；检测波长：250nm；流速：1mL/min，进样体积：10μL，流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1mol/L磷酸缓冲盐溶液，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件，选择自动匹配、平均数算法生成指纹图谱对照图谱；其中，通过PMP衍生物的高效液相色谱测定，比较色谱图，确定共有特征峰为8个，所述的8个共有特征峰以8号峰为参照的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于2％，即：1号峰相对保留时间为0.43，RSD为0.05％；2号峰相对保留时间为0.58，RSD为0.07％；3号峰相对保留时间为0.62，RSD为0.06％；4号峰相对保留时间为0.71，RSD为0.07％；5号峰相对保留时间为0.83，RSD为0.02％；6号峰相对保留时间为0.93，RSD为0.02％；7号峰相对保留时间为0.96，RSD为0.09％；8号峰相对保留时间为1.0，RSD为0％。2.根据权利要求1所述的杜仲多糖指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述1号峰对应甘露糖，相对峰面积为0.20％，RSD为2.82％，所述2号峰对应鼠李糖，相对峰面积为0.18％，RSD为2.64％，所述3号峰对应葡萄糖醛酸，相对峰面积为0.10％，RSD为1.87％，所述4号峰对应半乳糖醛酸，相对峰面积为0.72％，RSD为1.16％，所述5号峰对应葡萄糖，相对峰面积为0.79％，RSD为1.23％，所述6号峰对应半乳糖，相对峰面积为1.46％，RSD为0.63％，所述7号峰对应木糖，相对峰面积为0.15％，RSD为1.17％，所述8号峰对应阿拉伯糖，相对峰面积为1.00％，RSD为0.00％。3.根据权利要求2所述的杜仲多糖指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述各单糖根据与杜仲多糖待测品衍生化反应条件及分析条件相同的单糖混标溶液的保留时间对照定性；单糖混合标准溶液的衍生化反应操作同权利要求1步骤(2)所述，将其中“向水解液中加入NaOH溶液和PMP甲醇溶液”改为“向单糖混标溶液中加入NaOH溶液和PMP甲醇溶液”。4.根据权利要求3所述的杜仲多糖指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述单糖混标溶液由浓度分别为1mg/mL的D(+)-Glc、D-Man、D-(+)-Gal、L-Rha、D-(+)-Xyl、D-Rib、L-Ara、D-2CN112362776A权利要求书2/2页GalUA、D-Glc