D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112725255A(43)申请公布日2021.04.30(21)申请号202110165094.8C12N11/10(2006.01)(22)申请日2021.02.06C12N11/04(2006.01)C12P19/24(2006.01)(71)申请人江南大学C12P19/02(2006.01)地址214000江苏省无锡市滨湖区蠡湖大C12R1/125(2006.01)道1800号(72)发明人饶志明魏玉霞张显胡孟凯杨套伟徐美娟邵明龙(74)专利代理机构哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司23211代理人林娟(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N9/96(2006.01)C12N15/61(2006.01)C12N11/14(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表3页附图1页(54)发明名称D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法(57)摘要本发明公开了D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法，属于生物技术领域。本发明通过在DSDPEase基因N端融合SAPs，筛选出热稳定性提高的SAPs‑DSDPEase重组菌株。为提高重复利用性，本发明通过添加适当比例的二氧化钛与海藻酸钠形成混合固定化载体，制备固定化细胞。重组菌株B.subtilis168/pMA5‑SAP1‑DSDPEase40℃孵育48h后残余酶活为58％。按照优化后的条件制备的固定化细胞连续操作10次，固定化小球机械强度依然维持在80％，残余酶活回收率保留58％。利用固定化细胞合成D‑阿洛酮糖，催化反应80min，D‑阿洛酮糖产量可达153.3g/L，转化率为30.4％。CN112725255ACN112725255A权利要求书1/1页1.一种表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的N端融合双亲短肽的D‑阿洛酮糖异构酶基因。2.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168为宿主，以pMA5为表达载体。3.一种固定化细胞，其特征在于，包埋有权利要求1或2所述重组菌。4.一种固定化细胞的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1)将权利要求1或2所述重组菌在培养基中培养获得发酵液，并离心收集细胞；2)将细胞重悬并加入海藻酸钠溶液和二氧化钛，获得混合物；3)以0.5‑1.5d/s的速度将混合物滴入CaCl2溶液中，硬化得到微球；4)用生理盐水洗涤微球并去除水分，得到固定化细胞；5)将制备好的固定化细胞置于戊二醛溶液中交联。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤2)中海藻酸钠溶液浓度为1.5‑2％，二氧化钛是海藻酸钠质量的1/2～1/4。6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤2)中细胞的终浓度为60‑70g/L。7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤3)中CaCl2溶液浓度为2％。8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述步骤5)中戊二醛溶液浓度为0.01～0.04％。9.一种固定化细胞生产D‑阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述方法为在发酵罐中加入溶于pH6‑8.5缓冲液的D‑果糖溶液，加入权利要求3所述固定化细胞，转速180‑220转/分，转化温度45‑55℃，反应50‑100min。10.权利要求1或2所述重组菌或权利要求3所述固定化细胞在制备D‑阿洛酮糖或制备含有D‑阿洛酮糖的食品、膳食补充剂或医药制剂的应用。2CN112725255A说明书1/10页D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法技术领域[0001]本发明涉及D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶重组菌株的构建及全细胞固定化方法，属于生物技术领域。背景技术[0002]D‑阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的己酮糖单糖，其甜度相当于蔗糖的70％，热量相当于蔗糖的0.3％，具有与蔗糖相近的口感及容积特性，同样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应可作为食品中蔗糖理想的替代品。毒理学实验证实，D‑阿洛酮糖的半数致死量(LD50)为16.3g/kg，相比果糖的LD50为14.7g/kg，赤藻糖醇的LD50为15.3g/kg，根据毒性评级，D‑阿洛酮糖属于“相对无害”类别(毒性评级最低)。2014年，美国食品药品监督管理局(U.S.FoodandDrugAdministration，FDA)正式批准D‑阿洛酮糖为一般公认安全(GenerallyRecognizedasSafe，GRAS)，允许其应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中。D‑阿洛酮糖具有多种保健作用，可抗高血糖症，预