一种地加瑞克的固相合成方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112876541A(43)申请公布日2021.06.01(21)申请号201911198324.X(22)申请日2019.11.29(71)申请人深圳翰宇药业股份有限公司地址518057广东省深圳市南山区高新技术工业园中区翰宇生物医药园办公大楼四层(72)发明人陶志强尹传龙陶安进余品香(74)专利代理机构北京市诚辉律师事务所11430代理人范盈(51)Int.Cl.C07K7/23(2006.01)C07K1/20(2006.01)C07K1/06(2006.01)C07K1/04(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图7页(54)发明名称一种地加瑞克的固相合成方法(57)摘要本发明公开了一种地加瑞克的固相合成方法，包括以下步骤：1)肽树脂的偶联：按照Fmoc固相合成方法，逐个偶联氨基酸Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-4Cpa-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH至固相载体上；2)肽树脂N端乙酰化；3)肽树脂裂解后获得地加瑞克粗肽。本发明用Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH替代Fmoc-4Aph(Hor)-OH为原料依序进行偶联，从而降低异构化杂质的产生，将粗肽中异构化杂质降低至0.01％(也可能没有，为噪音)，从而减少了纯化难度，提高了纯化收率。CN112876541ACN112876541A权利要求书1/2页1.一种地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：1)肽树脂的偶联：按照Fmoc固相合成方法，逐个偶联氨基酸Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-4Cpa-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH至固相载体上；2)肽树脂N端乙酰化；3)肽树脂裂解后获得地加瑞克粗肽。2.根据权利要求1所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，1)中所述固相载体为RinkAmideAMResin、RinkAmideMBHAResin或RinkAmideResin；所述固相载体的替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.3-0.5mmol/g。3.根据权利要求1所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，1)中所述Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH的制备方法为：a、以Fmoc-4Aph-OMe为原料和2-甲氧基-4-乙酰氧基苯甲醛在NaBH3CN的作用下进行还原氨化反应得到Fmoc-4-Aph(Hmb)-OMe，反应温度为室温，反应时间为10-14小时，反应溶剂为二氧六环和水混合溶剂，所述二氧六环和水的体积比为1:1；b、然后在EDC/HOBt/DIPEA作用下，在二氯甲烷溶剂中与氢化乳清酸室温反应2-4小时，得到Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OMe；c、然后在氢氧化锂的作用下，以四氢呋喃为溶剂，室温搅拌3-5时获得Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OH。4.根据权利要求3所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述Fmoc-4Aph-OMe、2-甲氧基-4-乙酰氧基苯甲醛及NaBH3CN的摩尔比为1:1:1～1:1.5:1.5；所述b中a制备得到的Fmoc-4-Aph(Hmb)-OMe、EDC、HOBt、DIPEA和氢化乳清酸的摩尔比为1:1:1:3:1～1:1.5:1.5:3.75:1.5；所述c中b制备得到的Fmoc-4Aph(Hmb,Hor)-OMe和1mol/L氢氧化锂水溶液中氢氧化锂的摩尔比为1:1～1:5。5.根据权利要求1所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括以下步骤：将固相载体用溶剂进行溶胀；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-D-Ala-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-Pro-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将合适量的Fmoc-Lys(Boc,iPr)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检