一种酶交联聚集体及其制备方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115029326A(43)申请公布日2022.09.09(21)申请号202210584371.3(22)申请日2022.05.27(71)申请人湖南福来格生物技术有限公司地址410000湖南省长沙市长沙经济技术开发区漓湘西路7号申请人湖南农业大学(72)发明人周晶辉刘仲华张盛刘昌伟周自力赵士敏许岗(74)专利代理机构长沙市融智专利事务所(普通合伙)43114专利代理师袁靖(51)Int.Cl.C12N9/02(2006.01)C12N11/02(2006.01)A23L29/00(2016.01)权利要求书1页说明书8页附图2页(54)发明名称一种酶交联聚集体及其制备方法和应用(57)摘要本发明属于酶工程领域，涉及一种酶交联聚集体及其制备方法和应用，该方法相比现有传统的酶交联聚集体的制备方法，不需要用到有毒的化学交联试剂戊二醛，无需添加蛋白沉淀剂、省略了蛋白沉淀步骤，本发明所制备的酶交联聚集体酶活回收率高、热稳定性和有机溶剂耐受性好。利用本发明制备的酶交联聚集体用于茶黄素的催化合成，具有更高的产率和更多的批次使用性。CN115029326ACN115029326A权利要求书1/1页1.一种酶交联聚集体的制备方法，其特征在于，醌类与酶蛋白的氨基发生席夫碱反应或迈克尔加成反应，形成酶交联聚集体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的醌类是一类含有共轭双键的六元环状二酮结构有机化合物，如苯醌类、奈醌类、菲醌类、蒽醌类化合物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的醌类包括茶多酚的氧化产物。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的茶多酚的氧化产物包括表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯中的任意一种或几种组合的氧化产物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，利用多酚氧化酶、漆酶、酪氨酸酶中的一种或几种，在氧气和Cu2+存在的条件下，以茶多酚为底物，进行酶催化氧化反应获得茶多酚的氧化产物。6.根据权利要求1‑5任一项所述的制备方法，其特征在于，在整个交联反应体系中，所述的茶多酚的氧化产物浓度为0.4‑0.5mg/mL，用于交联的酶蛋白浓度0.5‑1mg/mL。7.根据权利要求1‑6任一项所述的方法，其特征在于：交联反应pH为6.5‑7.0，交联温度25‑35℃，交联反应时间至少为30min。8.一种酶交联聚集体，是由权利要求1‑7任一项所述的方法制备得到。9.权利要求8所述的酶交联聚集体的应用，用于催化反应。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，用于催化医药、食品、保健品的催化合成。2CN115029326A说明书1/8页一种酶交联聚集体及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于酶工程技术领域，涉及一种基于醌类为交联剂的酶交联聚集体及其制备方法和其在催化领域中的应用。背景技术[0002]酶的交联聚集体(cross‑linkedenzymeaggregates，CLEAs)是在2000年由荷兰RogerShelldon教授提出的一种新型的无载体固定化技术，该技术路线通常分为两个步骤：一是在溶液中对酶蛋白分子进行沉淀。其原理为在水溶液中加入沉淀剂，通常为无机盐(如硫酸铵、氯化钠)、有机溶剂、非离子聚合物等，可以使酶蛋白通过非共价键相互作用形成超分子结构‑不溶性的物理性聚集体；二是在形成沉淀的酶分子中加入化学交联剂进行酶分子之间的交联。目前常用的化学交联剂为戊二醛，戊二醛的醛基与酶蛋白分子上的氨基可以形成共价结合，形成不溶的酶交联聚集体沉淀CLEAs，该聚集体可以提高酶对有机溶剂的耐受性，并且可以使得多种酶被同时固定化，酶蛋白分子彼此交联形成聚集体，可以得到催化效率高、稳定性好、重复利用率高的固定化酶。[0003]利用该方法，RogerShelldon等人对7种商业化的脂肪酶进行了聚集体交联，得到了具有较好催化活性的CLEAs，该方法相比于有载体的固定化酶好处在于：(1)无需载体，节省了载体原材料的成本；(2)无需酶蛋白的分离纯化工艺步骤，细胞裂解液直接可用于固定化步骤，酶的分离纯化和固定化一步进行，固定化的工艺流程非常便捷，既节省了成本又保证了一定的酶活回收效率。但是，现有的几乎所有制备CLEAs的方法都需要用到化学交联剂戊二醛，戊二醛的使用，存在以下两个方面的问题：一是戊二醛有人体有毒，用作为交联剂使用可能会存在潜在的风险，同时对容易环境造成污染；二是戊二醛分子比较小，可进入酶聚集体内部交联酶分子中关键活性氨基酸残基位点的基团，会使得一些酶活性损失大；因此，开发一种环保、安全、高效、低成本的酶交联聚集体应用医药、食品、保健品等相关产品的催化合成具有重要的意义。[0004]茶多酚为茶叶