一种RNAi植物表达载体及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105802994A(43)申请公布日2016.07.27(21)申请号201610250521.1(22)申请日2016.04.20(71)申请人海南波莲水稻基因科技有限公司地址570125海南省海口市紫荆路2-1号紫荆信息公寓26A(72)发明人黄培劲安保光欧阳超陈思兰吴永忠(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)A01H5/00(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表10页附图2页(54)发明名称一种RNAi植物表达载体及其应用(57)摘要本发明提供了一种RNAi植物表达载体和其构建方法，以及，一种干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达的方法和获得除草剂显性敏感植物的方法。将RNAi植物表达载体转化水稻，能够成功抑制基因CYP81A6的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，从而培育了一种对除草剂显性敏感的水稻。使得敏感植株可以通过施用除草剂的方式被清除。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。CN105802994ACN105802994A权利要求书1/1页1.一种RNAi植物表达载体，其特征在于，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQIDNo.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。2.根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子，其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV35S启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。3.根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV35S启动子，或Actin启动子；所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因、荧光标记基因、抗生素标记基因、除草剂筛选标记基因或抗化学试剂标记基因，所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。5.一种RNAi植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将SEQIDNo.1所示的DNA片段插入到植物双元转化载体pTCK303的BamHⅠ和ClaⅠ位点间，得到中间载体1；将SEQIDNo.3所示的DNA片段插入到所述中间载体1的KpnⅠ、XholⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-P450i-2。6.权利要求1-4中任意一项所述的RNAi植物表达载体在干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达制备除草剂显性敏感植物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括将pTCK303-P450i-2导入农杆菌EHA105菌株，并转化植物愈伤组织。8.一种获得除草剂显性敏感植物的方法，其特征在于，包括将权利要求1-4中任意一项所述的RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物细胞色素P450基因CYP81A6表达。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括：(1)构建RNAi植物表达载体：将SEQIDNo.1所示的DNA片段插入到植物双元转化载体pTCK303的BamHⅠ和ClaⅠ位点间，得到中间载体1；将SEQIDNo.3所示的DNA片段插入到所述中间载体1的KpnⅠ、XholⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-P450i-2；(2)转化：将pTCK303-P450i-2导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化获得除草剂显性敏感植物。2CN105802994A说明书1/8页一种RNAi植物表达载体及其应用技术领域[0001]本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种能够抑制细胞色素P450基因表达的RNAi植物表达载体和其构建方法和应用。背景技术[0002]农作物杂种优势利用是农业增产重要手段之一。水稻是全世界最重要的粮食作物之一，具有明显的杂种优势。中国是世界上首个成功实现杂交水稻商品化生产的国家，杂交水稻使我国水稻产量提高了20％，全国杂交水稻常年种植面积已超过水稻年播种面积的50％。“三系法”和“两系法”是目前杂交水稻制种的主要方法，但由于三系核质互作的基因型限制及两系的光温敏在特殊条件下的不稳定，杂交水稻产业的发展已受到制约。美国先锋公司的SPT技术利用转基因技术成功解决了杂交制种中的一系列问题，并于2012年在玉米中实现商业