检测非洲猪瘟抗体的ASFV P30重组抗原蛋白、胶体金试纸条及其制备方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115819520A(43)申请公布日2023.03.21(21)申请号202211137319.XG01N33/558(2006.01)(22)申请日2022.09.19G01N33/543(2006.01)(71)申请人长沙兴嘉生物工程股份有限公司地址410300湖南省长沙市浏阳长沙国家生物产业基地康宁路370号(72)发明人黄逸强李尤美陈娟周长虹刘东波张亚伟王赏初(74)专利代理机构长沙朕扬知识产权代理事务所(普通合伙)43213专利代理师郭蓓霏(51)Int.Cl.C07K14/01(2006.01)C12N15/34(2006.01)G01N33/58(2006.01)G01N33/569(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表（电子公布）附图6页(54)发明名称检测非洲猪瘟抗体的ASFVP30重组抗原蛋白、胶体金试纸条及其制备方法和应用(57)摘要本发明属于兽医生物诊断制品技术领域，公开了一种检测非洲猪瘟抗体的ASFVP30重组抗原蛋白、胶体金试纸条及其制备方法和应用。该胶体金试纸条采用胶体金免疫层析技术，在含有胶体金的金标垫和检测线上包被有相同的ASFVP30重组抗原蛋白，可以采用双抗原夹心法进行非洲猪瘟抗体快速检测；针对当前免疫胶体金层析技术应用于非洲猪瘟检测中的缺陷，在准确性、灵敏度、检测方面具有较好的提升，其检测灵敏度可满足非洲猪瘟基因缺失毒株的检出。且该胶体金试纸条操作简便、成本低廉、检测快速、稳定，其结构中配置有滤血膜，对血液样本要求不高；可推进散养户、中小规模猪场或不具备ELISA试验条件的养殖场开展ASF规范管理。CN115819520ACN115819520A权利要求书1/2页1.一种检测非洲猪瘟抗体的ASFVP30重组抗原蛋白，其特征在于，所述ASFVP30重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种如权利要求1所述ASFVP30重组抗原蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因序列如SEQIDNO：1所示。3.一种检测非洲猪瘟抗体的胶体金试纸条，其特征在于，包括粘贴在底板(1)上的层析膜(2)，在所述层析膜(2)的一端粘贴有吸水垫(3)，另一端依次粘贴有金标垫(4)、滤血膜(5)、样品垫(6)；所述层析膜(2)上设有质控线(8)和检测线(9)，所述检测线(9)靠近样品垫(6)一侧设置，所述质控线(8)靠近吸水垫(3)一侧设置；所述检测线(9)由ASFVP30重组抗原蛋白喷涂形成，所述质控线(8)由IgY抗体喷涂形成；所述金标垫(4)上喷涂有与胶体金结合的ASFVP30重组抗原蛋白和IgY抗体；所述ASFVP30重组抗原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求3所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述底板(1)的基材为硬质塑料，所述层析膜(2)的基材为硝酸纤维素膜，所述吸水垫(3)的基材为吸水滤纸，所述金标垫(4)、样品垫(6)的基材为玻璃纤维素膜，所述IgY抗体为鸡IgY抗体、羊抗鸡IgY抗体、鼠IgG/IgM抗体、羊抗鼠IgG/IgM抗体或兔抗鼠IgG/IgM抗体。5.一种如权利要求3或4所述胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分别用ASFVP30重组抗原蛋白、IgY抗体标记胶体金，分别制备得到胶体金标记抗原蛋白、胶体金标记抗体；(2)将所述胶体金标记抗原蛋白和胶体金标记抗体混匀，喷涂于金标垫的基材上，干燥后即得金标垫；(3)将层析膜的基材粘贴在底板上，并在层析膜的基材上喷涂所述ASFVP30重组抗原蛋白和IgG抗体，分别形成检测线和质控线，干燥后即得层析膜；(4)将样品垫的基材在封闭液中充分浸泡，干燥后即得样品垫；(5)依次组装底板、层析膜、吸水垫、金标垫、滤血膜、样品垫，即得到所述的胶体金试纸条。6.根据权利要求5所述胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述胶体金标记抗原或胶体金标记抗体的制备方法依次包括如下步骤：在胶体金溶液中加入K2CO3溶液，混匀；加入ASFVP30重组抗原蛋白或IgY抗体，搅拌均匀后，加入BSA溶液于室温下进行封闭；通过离心依次除去未结合的胶体金颗粒、上清液，获得胶体金标记沉淀，即得到所述胶体金标记抗原蛋白或胶体金标记抗体；所述K2CO3溶液的浓度为0.1mol/L，其添加量为5～160μL/mL；所述ASFVP30重组抗原蛋白或IgY抗体用PBS稀释；所述ASFVP30重组抗原蛋白的标记量为5～50μg/mL，所述IgY抗体的标记量为5～50μg/mL；所述封闭的反应时间为10～30min；通过离心除去未结合的胶体金颗粒的参数条件为：4℃、1500rpm离心10～60min；通过离心除去上清液的参数条件为：4℃、15000rpm