一种检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115725609A(43)申请公布日2023.03.03(21)申请号202211414782.4G01N33/543(2006.01)(22)申请日2022.11.11G01N33/569(2006.01)(71)申请人中国农业科学院上海兽医研究所地址201100上海市闵行区紫月路518号(72)发明人魏建超马志永李昱昊张妍杨扬管志欣张俊杰郑家杨邱亚峰李宗杰李蓓蓓刘珂邵东华(74)专利代理机构台州浙粤垄专利代理事务所(普通合伙)33419专利代理师公茂海(51)Int.Cl.C12N15/34(2006.01)C12N15/70(2006.01)G01N33/532(2006.01)权利要求书2页说明书15页序列表（电子公布）附图5页(54)发明名称一种检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备及应用(57)摘要本发明涉及一种检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备及应用，属于分子诊断技术领域。为了克服现有技术的不足，本发明提供一种检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备方法，该方法通过分别合成ASFV的B646L基因和猪IgG的Fc基因，在其基因间创造性加入柔性蛋白基因后构建表达载体，将表达载体转化感受态细胞后进行诱导表达，表达的ASFV重组蛋白提取纯化后作为检测带，金黄色葡萄球菌蛋白A作为质控带即可得到，该试纸条的灵敏度可以达到1:320，特异性良好，与伪狂犬病毒、经典猪瘟病毒、乙脑病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪圆环病毒1型和2型均没有交叉反应，稳定性良好。CN115725609ACN115725609A权利要求书1/2页1.一种检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备方法，其包括如下步骤：(1)目的基因融合扩增：参照GenBank中ASFV(Pig/HLJ/2018株)基因的编码序列，分别合成ASFV的B646L基因和猪IgG的Fc基因，设计目的基因的上游引物和下游引物对目的基因进行扩增；B646L基因的基因序列SEQ.No.5所示，猪IgG的Fc基因的基因序列如SEQ.No.6所示；将Fc段基因与B646L基因融合之间增加15个氨基酸长的柔性蛋白基因进行融合PCR，其中柔性蛋白基因的基因序列如SEQ.No.7所示；向反应体系中加B646L基因的上游引物和Fc片段基因的下游引物各2μL，继续按照融合PCR的扩增程序扩增25个循环，反应结束后用1％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳鉴定，目的基因进行回收，测定浓度后置于‑20℃冰箱保存；(2)重组表达载体的构建与鉴定：将pColdI载体和回收的目的基因用XbaI和EcoRI内切酶在37℃水浴锅4h进行双酶切反应，酶切完成后用1％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳鉴定，目的片段回收后测定浓度置于‑20℃冰箱保存；使用T4连接酶对目的片段和pColdI载体进行16℃过夜连接反应，将连接产物加入到DH5α感受态细胞中转化，转化完成后菌液涂到氨苄抗性的平板上37℃培养过夜，挑取单菌落至含有氨苄抗性的LB培养基中放置37℃培养箱培养6h，选取阳性单克隆；(3)ASFV重组蛋白的原核表达、纯化及鉴定：将构建完成的阳性重组质粒转化至感受态细胞中BL21(DE3)，挑选单克隆菌培养过夜，取1mL菌液加入至200mLLB培养基中，摇床培养至OD在0.6‑0.8时，加入IPTG使其在1mM的IPTG浓度下诱导表达；将菌液进行冰浴超声破碎后进行冷冻离心提取包涵体蛋白，使用8M尿素的裂解液重悬沉淀，使用Ni2+亲和层析方法对重组蛋白进行纯化，使用抗His标签单抗作为一抗，用带有HRP的羊抗鼠二抗对诱导表达后得到的ASFV重组蛋白进行Western‑blot鉴定；(4)检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备：将金标垫提前用重悬液进行浸润后，放置烘箱中烘干，然后将PVC底板、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装在一起，将纯化的p54‑Fc蛋白和SPA稀释至0.5mg/mL，分别标记到硝酸纤维素膜的检测线上和质控线上，即得检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条。2.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述的B646L基因上游引物如SEQ.No.1所示，B646L基因下游引物如SEQ.No.2所示，Fc基因的上游引物如SEQ.No.3所示，Fc基因的下游引物如SEQ.No.4所示，扩增反应体系的组成为：模板DNA2μL，上、下游引物各2μL，TapDNA聚合酶mix25μL，ddH2O19μL；所述融合PCR的反应体系为：模板DNA2μL，Fc基因2μL，TapDNA聚合酶mix25μL，ddH2O17μL；融合PCR扩增程序为：95℃5min，95℃30s；58℃60s；72℃30‑120s；10个循环，72℃5min。3.根据权利要求1所述的