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本发明涉及分子生物学技术领域,特别是涉及一种富集目标区域再酶切构建单倍型的方法,所述方法包括以下步骤:1)富集目标核酸区域;2)设计仅能与目标核酸区域中的一个单倍体结合的向导序列,利用向导序列以及限制性核酸内切酶酶切步骤1)富集的目标核酸区域,分别回收酶切片段和/或未被酶切的片段;3)利用步骤2)回收的酶切片段和/或未被酶切的片段分别制备测序文库并测序,数据分析分别得到酶切片段和/或未被酶切的片段的核酸序列的SNP信息,即为目标核酸区域的单倍型信息。本发明的方法可以靶向基因组上一个较小区域且实验操作简便、成本低。