一种靶基因区域快速富集方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113913493A(43)申请公布日2022.01.11(21)申请号202010647922.7(22)申请日2020.07.07(71)申请人天昊基因科技（苏州）有限公司地址215123江苏省苏州市中国（江苏）自由贸易试验区苏州片区苏州工业园区星湖街218号生物纳米园C13楼501单元(72)发明人姜正文丁慧(74)专利代理机构上海一平知识产权代理有限公司31266代理人肖艳徐迅(51)Int.Cl.C12Q1/6806(2018.01)C12Q1/6813(2018.01)C12Q1/6869(2018.01)权利要求书2页说明书16页序列表17页附图2页(54)发明名称一种靶基因区域快速富集方法(57)摘要本发明提供了一种靶基因区域快速富集方法。所述方法采用抗外切核酸酶修饰的延伸引物和/或阻滞探针，在引物探针对与样本DNA变性杂交后进行单链核酸特异外切酶酶切纯化，经酶切纯化的产物再通过磁珠纯化、硅胶柱纯化或膜过滤纯化等物理方法二次纯化，然后采用与二代测序平台相匹配的通用引物进行扩增纯化获得测序文库。本发明的方法可以实现多重目的基因片段的快速富集，显著提高靶序列的富集效率，提高目的基因片段的有效读数和测序深度，可以用于各种高通量芯片测序平台如二代测序平台的测序分析。CN113913493ACN113913493A权利要求书1/2页1.一种核酸片段的富集方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)提供一反应体系，所述反应体系包括：待测样本、n个探针组；其中，所述n≥2，各个探针组中分别包含第一探针和第二探针；所述第一探针和所述第二探针分别与同一条目标核酸片段的3’端和5’端特异性杂交(所述特异性杂交是指至少部分互补或完全互补)；所述第一探针不能被5’->3’方向核酸外切酶降解和/或所述第二探针不能被3’->5’方向核酸外切酶降解；所述第一探针包括与目标核酸片段3’端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列相对应的第二部分(所述相对应是指所述第二部分的反向互补序列与PCR扩增引物能够特异性杂交)；所述第二探针包括与目标核酸片段5’端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列特异性杂交的第二部分；当所述第一探针和所述第二探针与同一目标核酸片段特异性杂交时，所述第一探针的3’末端与所述第二探针的5’末端至少间隔1个核苷酸的距离；(2)对所述反应体系进行高温变性、退火处理，所述第一探针和所述第二探针在高温变性、退火过程中与所述待测样本的目标核酸片段特异性杂交形成杂交产物，从而获得反应混合物I，所述反应混合物I中含有所述杂交产物；(3)用一种或多种单链核酸特异外切酶对所述的反应混合物I进行消化处理，从而消化去除未与目标核酸片段杂交的第一探针和第二探针，从而获得经消化的反应混合物II，所述反应混合物II中含有未被消化的所述杂交产物；(4)对所述反应混合物II进行纯化处理，进一步去除残留的未与目标核酸片段杂交的第一探针和第二探针，从而获得经纯化的、含所述杂交产物的反应混合物III；(5)利用核酸聚合酶和核酸连接酶对所述反应混合物III中的所述杂交产物进行延伸连接反应形成连接产物，从而获得含连接产物的反应混合物IV；和(6)以所述反应混合物IV中的连接产物为模板，进行PCR扩增，从而获得PCR扩增产物，即为富集的核酸片段。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，在所述核酸聚合酶作用下，所述第一探针沿所述目标核酸片段进行DNA链延伸，延伸至所述第二探针的5’末端时被其阻滞，获得第一探针延伸DNA链；以及在所述核酸连接酶的作用下，将所述第一探针延伸DNA链3’端与所述第二探针5’端连接，从而形成含连接产物的反应混合物。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针不能被5’->3’方向核酸外切酶降解，并且步骤(3)中所用的核酸外切酶为5’->3’方向单链核酸特异外切酶；和/或所述第二探针不能被3’->5’方向核酸外切酶降解，并且步骤(3)中所用的核酸外切酶为3’->5’方向单链核酸特异外切酶。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述n(探针组的种数)为20-1000000，优选为30-500000，更优选为40-100000，最优选为50-10000。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中纯化处理包括：磁珠纯化、硅胶柱纯化、膜过滤纯化、乙醇或异丙醇沉淀纯化、或其组合。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二探针的5'端是经磷酸化修饰的。2CN113913493A权利要求书2/2页7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸聚合酶为高温耐热核酸聚合酶；和/或所述核酸连接酶为高温耐热核酸连接酶。8.如权利