BTK突变细胞株及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115851606A(43)申请公布日2023.03.28(21)申请号202211635171.2C12N15/867(2006.01)(22)申请日2022.12.19C12Q1/02(2006.01)C12R1/91(2006.01)(71)申请人北京爱思益普生物科技股份有限公司地址100176北京市大兴区经济技术开发区科创十三街18号院16号楼1层101(72)发明人邴铁军覃艳艳王爱成侯琳黄聪李英骥(74)专利代理机构北京八月瓜知识产权代理有限公司11543专利代理师李海菊(51)Int.Cl.C12N5/10(2006.01)C12N15/54(2006.01)C12N9/12(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表（电子公布）附图13页(54)发明名称BTK突变细胞株及其构建方法和应用(57)摘要本发明涉及细胞工程技术领域，尤其是涉及BTK突变细胞株及其构建方法，包括如下步骤：S1、使用慢病毒载体质粒构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒；S2、使用转染试剂将步骤S1获得的重组质粒与慢病毒包装质粒转入HEK‑293T细胞；S3、收集步骤S2的病毒上清，过滤并收集含有病毒的滤出液，然后感染HEK‑293细胞；S4、将HEK‑293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池；S5、将细胞池消化后接种到细胞孔板中，继续用抗生素筛选，至孔中单克隆长至一定汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至新的细胞孔板中，最终获得BTK突变细胞株。本发明的方法能够得到稳定的BTK突变耐药株，用于癌症药物的筛选。CN115851606ACN115851606A权利要求书1/1页1.BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、使用慢病毒载体质粒构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒；S2、使用转染试剂将步骤S1获得的重组质粒与慢病毒包装质粒转入HEK‑293T细胞；S3、收集步骤S2的病毒上清，过滤并收集含有病毒的滤出液，然后感染HEK‑293细胞；S4、将HEK‑293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池；S5、将细胞池消化后接种到细胞孔板中，继续用抗生素筛选，至孔中单克隆长至一定汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至新的细胞孔板中，最终获得BTK突变细胞株。2.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述的BTK基因及其突变基因包括：BTK基因及其T316A，T474S，T474M，T474M‑E513G，C481A，C481Y，C481F，C481R位点突变的突变基因；所述BTK基因序列如SEQIDNO：1所示，所述T316A位点突变的突变基因序列如SEQIDNO：2所示，所述T474S位点突变的突变基因序列如SEQIDNO：3所示，所述T474M位点突变的突变基因序列如SEQIDNO：4所示，所述T474M‑E513G位点突变的突变基因序列如SEQIDNO：5所示，所述C481A位点突变的突变基因序列如SEQIDNO：6所示，所述C481Y位点突变的突变基因序列如SEQIDNO：7所示，所述C481F位点突变的突变基因序列如SEQIDNO：8所示，所述C481R位点突变的突变基因序列如SEQIDNO：9所示。3.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S1包括：使用Plvx‑Puro载体质粒，构建含有BTK基因及其突变基因的重组质粒。4.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S2包括：使用Lipo3000将步骤S1获得的重组质粒与PSPAX2质粒、PVSVG质粒转入HEK‑293T细胞。5.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S3包括：48小时后收集步骤S2的病毒上清，用2μm滤器过滤，然后感染HEK‑293细胞8‑12h。6.根据权利要求1所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S4包括：第二天更换培养液，第三天将HEK‑293细胞消化后接种至新的培养皿中，同时加抗生素进行筛选，每隔2～3天更换培养液，筛选出阳性细胞至细胞群出现，形成稳转细胞池。7.根据权利要求6所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，所述的抗生素为嘌呤霉素。8.根据权利要求7所述的BTK突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S5包括：将细胞池消化后接种到96孔板中，继续用嘌呤霉素筛选2‑3周左右，至孔中单克隆长至50％以上汇合度时，挑取单克隆，进行扩大培养至24孔板中，最终获得BTK突变细胞株。9.根据权利要求1‑8任一项所述的BTK突变细胞株的构