一种TRPC5突变细胞株及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927202A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202310035178.9C12Q1/02(2006.01)(22)申请日2023.01.10(71)申请人北京爱思益普生物科技股份有限公司地址100176北京市大兴区经济技术开发区科创十三街18号院16号楼1层101(72)发明人陈兰兰周芳宇甄海燕赵婷张红(74)专利代理机构北京八月瓜知识产权代理有限公司11543专利代理师袁晓雨(51)Int.Cl.C12N5/10(2006.01)C12N15/85(2006.01)C12N15/12(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图4页(54)发明名称一种TRPC5突变细胞株及其构建方法和应用(57)摘要本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种TRPC5突变细胞株及其构建方法和应用，所述TRPC5突变细胞株为TRPC5‑478T>C突变细胞株，具体构建方法为将TRPC5编码区碱基序列的第478位T突变为C，将突变后的序列构建到载体中，并通过脂质体转染的方法转到细胞中，经筛选得到TRPC5突变细胞株。本发明的TRPC5‑478T>C突变细胞株，在使用激动剂开放TRPC5通道后能够使更多的一价阳离子Na+和K+及二价阳离子Ca2+进入细胞内，改善了全细胞膜片钳检测电流小的问题，增加了FLIPR检测中钙流/膜电位信号强度，进而完善了TRPC5小分子抑制剂药物筛选方法，为快速确定局灶节段性肾小球硬化疾病小分子抑制剂候选药物的筛选奠定了基础。CN115927202ACN115927202A权利要求书1/1页1.一种TRPC5突变细胞株，其特征在于，所述TRPC5突变细胞株为TRPC5‑478T>C突变细胞株。2.权利要求1所述TRPC5突变细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将TRPC5编码区碱基序列的第478位T突变为C，将突变后的序列构建到载体中，并通过脂质体转染的方法转到细胞中，经筛选得到TRPC5突变细胞株。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述载体为pcDNA3.1/Zeo(+)。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述转染时，将构建好的TRPC5‑478T>C‑pcDNA3.1/Zeo(+)质粒通过脂质体转染的方法转到HEK293细胞中，经培养得到多克隆细胞。5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述筛选包括抗生素筛选和单克隆筛选。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述抗生素筛选时，在多克隆细胞池培养基中加入终浓度为80‑120μg/mL的博莱霉素筛选4‑6天，筛选后的多克隆细胞进行稀释，并选择单个克隆细胞株进行扩大培养。7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述单克隆筛选包括qRT‑PCR筛选和全细胞膜片钳法筛选。8.权利要求1所述TRPC5突变细胞株的应用，其特征在于，所述TRPC5突变细胞株在药物筛选中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物筛选时，基于TRPC5突变细胞株，通过全细胞膜片钳方法和FLIPR钙流或膜电位方法，建立针对TRPC5靶点的高通量小分子药物筛选技术。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述FLIPR钙流或膜电位检测方法建立时，通过全细胞膜片钳方法验证通道激动剂EC50和抑制剂IC50，筛选出IC50≤3的单克隆进行FLIPR钙流或膜电位方法的建立。2CN115927202A说明书1/5页一种TRPC5突变细胞株及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种TRPC5突变细胞株及其构建方法和应用。背景技术[0002]TRPC5是受体激活的非选择性阳离子通道，属于瞬时受体电位通道（TRP）家族中的经典型亚家族（TRPC），它是细胞膜上能通过钙离子的非选择性通道，TRPC5通道的激活将引起细胞膜去极化和胞质内钙浓度上升。[0003]TRPC5通道主要表达于脑组织，在肝脏、肾脏等器官中也有一定程度的分布。此外，TRPC5介导多种生理过程，与恐惧、焦虑、抑郁等情绪的产生以及肾脏疾病密切相关。近期研究发现，TRPC5通道是治疗焦虑、抑郁和肾病的潜在药物靶点。[0004]目前，对于TRPC5稳定细胞系的构建大多以TRPC5‑WT型进行构建，通过蛋白印迹实验筛选出TRPC5蛋白表达量较高的单克隆，后续使用表达量较高的此单克隆细胞，并基于手动膜片钳技术进行电生理学方法建立，记录内向电流及外向电流的大小。然而，基于手动膜片钳技术的检测方法存在低吞吐量，高成本，无法实现高通量低成本的药物筛选工作。[0005]此外，基于荧光高通量检测的FLIPR钙流或膜电位非电生理筛选方法，也无较为成熟的报道。例如，运用瞬时转染TRPC