一种环肽融合蛋白及其制备方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115894711A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202211126556.6A61K38/12(2006.01)(22)申请日2022.09.16A61K38/58(2006.01)C12R1/84(2006.01)(71)申请人重庆派金生物科技有限公司地址400700重庆市北碚区丰和路106号(72)发明人梅鑫杨辉栾秋洋丁琼冷国政刘日勇范开(74)专利代理机构重庆中之信知识产权代理事务所(普通合伙)50213专利代理师要然(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N15/81(2006.01)C12N1/19(2006.01)C07K1/20(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种环肽融合蛋白及其制备方法与应用(57)摘要本发明提供了一种一种环肽融合蛋白及其制备方法与应用。所述环肽融合蛋白包括水蛭素C端肽段、水蛭素N端肽段和环肽，其结构式如下：其中，HV‑N为水蛭素N端肽段，HV‑C为水蛭素C端肽段，K为接头肽。本发明可在酵母表达系统中高效表达环形多肽，且环形多肽能够形成正确二硫键配对。CN115894711ACN115894711A权利要求书1/1页1.一种环肽融合蛋白，其特征在于：所述环肽融合蛋白包括水蛭素C端肽段、水蛭素N端肽段和环肽，其结构式如下：其中，HV‑N为水蛭素N端肽段，HV‑C为水蛭素C端肽段，K为接头肽。2.如权利要求1所述的环肽融合蛋白，其特征在于：所述环肽融合蛋白经融合表达后，能够自发形成正确的二硫键配对。3.如权利要求1所述的环肽融合蛋白，其特征在于：所述水蛭素N端肽段包括水蛭素N端1‑15位氨基酸中的至少部分序列，所述水蛭素C端肽段包括水蛭素C端40‑65位氨基酸中的至少部分序列，其中，水蛭素N端含有2个半胱氨酸。4.如权利要求1所述的环肽融合蛋白，其特征在于：所述环肽包括10‑40个氨基酸，其中含有2、4或6个半胱氨酸；和/或，所述接头肽包括K、PK，DPK，EPK、KR中的一种或几种；和/或，所述水蛭素包括1)天然水蛭素及其异构体；或2)天然水蛭素的氨基酸序列经缺失、替代或增加一个或几个氨基酸得到的与水蛭素具有相同功能的多肽；或3)与天然水蛭素有50％以上同源性的水蛭素类似物；其中，水蛭素N端含有2个半胱氨酸，优选地，所述水蛭素的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；和/或，所述环肽融合蛋白还包括蛋白标签，优选地，所述蛋白标签为组氨酸标签。5.如权利要求1所述的环肽融合蛋白，其特征在于：所述环肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。6.一种核酸分子，其含有编码权利要求1‑5任一项所述的环肽融合蛋白的核苷酸序列，优选地，所述核苷酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。7.一种表达载体，含有权利要求6所述的核酸分子。8.一种宿主细胞，含有权利要求7所述的表达载体。9.一种组合物或制剂，含有权利要求1‑5任一项所述的环肽融合蛋白、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的宿主细胞中的一种或几种。10.权利要求1‑5任一项所述环肽融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)构建编码环肽融合蛋白的载体；2)将步骤1)中的载体转入宿主细胞表达，得到环肽融合蛋白；优选地，所述宿主细胞为酵母，更优选的，所述酵母为毕赤酵母，所述毕赤酵母优选X‑33或GS115；优选地，所述载体为含有分泌信号肽的载体，所述信号肽优选为α因子信号肽；优选地，还包括步骤3)，将环肽融合蛋白酶切、纯化得到环肽；优选地，所述酶切为用Lys‑c或Kex2蛋白酶酶切，酶与底物的质量比为1:20～1:1000，pH为8.0～9.5；或用CPB蛋白酶酶切，酶与底物的质量比为1:200～1:2000，pH为8.0～9.5；所述纯化为反向层析法。2CN115894711A说明书1/6页一种环肽融合蛋白及其制备方法与应用技术领域[0001]本发明涉及融合蛋白技术领域，尤其涉及一种环肽融合蛋白及其制备方法与应用。背景技术[0002]环肽药物是具有环状结构的多肽链，多数由5‑14个氨基酸组成，凭借其高效的结合亲和力、靶向选择性、低毒性及代谢稳定性等良好的成药特性,逐渐成为药物研究的新兴方向。据统计(HuiyaZhang,etc.Cyclicpeptidedrugsapprovedinthelasttwodecades(2001–2021)[J].RSCChemicalBiology,2022,3.)，近20年，共有18款环肽药物上市,作用于细胞壁合成和β‑1,3‑葡聚糖酶的环肽数量最多，各有3款，均为抗微生