一种猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆在灭活疫苗中的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106701822A(43)申请公布日2017.05.24(21)申请号201510794642.8(22)申请日2015.11.13(71)申请人广东永顺生物制药股份有限公司地址511356广东省广州市萝岗区永和经济区田园西路35号(72)发明人唐志玲林旭埜林德锐齐冬梅穆光慧刘秋燕朱炜斌邹伟斌张震(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N7/08(2006.01)A61K39/12(2006.01)A61P31/20(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书4页说明书11页附图2页(54)发明名称一种猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆在灭活疫苗中的应用(57)摘要本发明涉及一种猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆的构建及其在灭活疫苗中的应用，该猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆经细胞转染、传代后用于PCV2灭活疫苗的制作。通过采用适当的基因工程技术方法，基于临床分离得到的PCV2基因组DNA，设计特异性引物，经PCR获得全长基因，将两个拷贝的PCV2全长基因以首尾相连的方式串联连到pEGFP-N1载体上，形成PCV2双拷贝全基因重组质粒，转染ST细胞连续盲传60代，借助PCR检测方法以及间接免疫荧光实验技术(IFA)对其在ST细胞上的感染性以及病毒增殖稳定性进行鉴定，为PCV2灭活疫苗的研制奠定了基础。CN106701822ACN106701822A权利要求书1/4页1.一种猪圆环病毒2型(PCV2)双拷贝感染性克隆在灭活疫苗中的应用，该猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆经细胞转染、传代后用于PCV2灭活疫苗的制作，该猪圆环病毒2型双拷贝感染性克隆的拯救方法包括以下四个步骤：步骤一：双拷贝感染性克隆pEGFP-N1-BD的构建：(1)PCV2DNA的提取a、从临床PMWS症状猪群中分离得到PCV2毒株，对其进行基因比对和序列分析；取含PCV2-GD毒株的细胞培养物200μL，加入20μLProteinaseK溶液，混匀；b、加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，待溶液变清亮简短离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15秒，简短离心去除管壁盖内壁的水珠；c、将上一步所得溶液加入到试剂盒配的吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前加入适量无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；d、向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW(使用前加入适量无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中，该步骤重复两次，然后将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液，将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加60μL洗脱液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，收集病毒基因组DNA，-20℃保存备用。(2)设计引物和选择酶切位点第一对引物：GDF1：cgctcgaggctggctgaacttttg，GDR1cgaccgcggaaatttctgacaaacg，上游引物GDF1下划线部分是XhoI酶切位点，下游引物GDR1下划线部分是SacII酶切位点；第二对引物：GDF2：catccgcgggctggctgaacca，GDR2caggatccaaatttctgacaaacgttacaggg，上游引物GDF2下划线部分是SacII酶切位点，下游引物GDR2下划线部分是BamHI酶切位点；(3)全基因扩增以上述DNA为模板，利用设计的2对PCR引物GDF1/GDR1，GDF2/GDR2分别扩增两个拷贝的PCV2-GD全基因组片段(即片段B、D)；扩增条件为：95℃预变性4min，94℃变性1min，54℃退火1min30s，72℃延伸3min，30个循环，72℃延伸10min；PCR反应体系如下：高保真酶PrimerSTAR1μL，10×Buffer5μL，dNTPMix8μL，PCV2-GDDNA1μL，GDF1/GDF22.5μL，GDR1/GDR22.5μL，ddH2O30μL，总共计50μL；PCR结束后取5μLPCR产物在10g/L的琼脂糖凝胶上电泳检测；(4)双拷贝全基因感染性分子克隆的构建将纯化后的B片段与pEGFP-N1质粒用XhoI酶、SacII酶进行同步双酶切，切胶回收后再将二者按一定比例相连，连接采用10μL体系：B片段4μL，双酶切的载体pEGFP-N11μL，连接酶LigationHigh(含Buffer)5μL，随后转化到DH5α