用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106868166A(43)申请公布日2017.06.20(21)申请号201710178811.4(22)申请日2017.03.23(71)申请人山东师范大学地址250014山东省济南市文化东路88号(72)发明人何洪彬赵贵民王洪梅侯佩莉(74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221代理人王志坤(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表1页附图3页(54)发明名称用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物、探针及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQIDNo.1所示，反向引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示。本发明还公开了用于检测副结核分支杆菌的试剂盒。本发明提供的副结核分支杆菌RPA-nfo检测引物与探针组合以及试剂盒灵敏度高、特异性强，最低可以检测到8拷贝/反应的副结核分支杆菌DNA。无需特殊仪器设备，借助恒温水浴锅或人体腋窝温度，25min就能对待测样本的粗裂解物进行副结核分支杆菌DNA的灵敏、特异、快速地检测，适合现场或基层副结核病的诊断工作。CN106868166ACN106868166A权利要求书1/2页1.一种用于现场快速检测副结核分支杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针的序列如下所示：正向引物：5'-TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT-3'；(SEQIDNO.1)反向引物：5'-(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG-3'；(SEQIDNO.2)探针：5'-(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3-Spacer)-3'(SEQIDNO.3)。2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备副结核分支杆菌检测的试剂盒、芯片和/或扩增反应试剂中的用途。3.一种检测副结核分支杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控标准品为包括副结核分支杆菌IS900基因片段的阳性质控标准品；优选的，所述副结核分支杆菌IS900基因片段阳性质控标准品由含有259个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；所述含有259个碱基的核苷酸片段的序列如SEQIDNo.4所示。6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA-nfo反应液，包括下述试剂中的至少一种：recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、rehydration缓冲液、280mM醋酸镁溶液、侧流层析试纸条、LFD检测缓冲液、灭菌去离子双蒸水，TE缓冲液、SDS、蛋白酶K和副结核分支杆菌标准阳性模板。8.一种非诊断目的的检测副结核分支杆菌的方法，其特征在于，步骤如下：(1)检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，利用权利要求1所述的引物和探针组合进行RPA-nfo扩增；(3)用LFD检测上述RPA-nfo扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有副结核分支杆菌。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RPA-nfo扩增的体系为25μL：其中包括1.0μL的正向引物，1.0μL的反向引物，0.3μL的探针，rehydration缓冲液14.75μL，待测样本DNA或粗裂解产物2μL，ddH2O4.7μL；将上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接在37℃恒温水浴锅处理25min。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(3)的具体步骤为：取1μLRPA扩增产物与49μL的LFD检测缓冲液混合，将LFD置入上述混合液中，5min内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品副结核分支杆菌核酸阳性，仅出现对照条带则说明该样品中不2CN106868166A权利要求书2/2页含副结核分支杆菌，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。3CN106868166A说明书1/