一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109971814A(43)申请公布日2019.07.05(21)申请号201811551991.7(22)申请日2018.12.19(71)申请人浙江神洲药业有限公司地址317300浙江省台州市仙居县城关穿城南路14号(72)发明人王友富王荣王炳乾王洪福邵振平雷灵芝黄橙橙王瑞陈克纲应杨波(74)专利代理机构北京红福盈知识产权代理事务所(普通合伙)11525代理人陈月福(51)Int.Cl.C12P33/00(2006.01)C12R1/32(2006.01)权利要求书2页说明书6页(54)发明名称一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法(57)摘要本发明涉及孕烯醇酮制备技术领域，公开了一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，步骤为，S1：取保存好的金色分支杆菌接种在PDA平板上，30℃下培养3d，待金色分支杆菌长满平板后，将无菌Tritonx-1000.1％5mL注入平板，轻摇使金色分支杆菌孢子均匀分散取，将悬浮液接种于沙仕固体培养基中，于30℃恒温培养36h；S2：将步骤S1中培养36h后的金色分支杆菌平板置于无菌紫外灯下照射处理，照射强度为285.8W/c㎡，照射时间为5-15min，然后将处理过的平板在光照下30℃培养36h，取出样本；S3：将步骤S2中培养后的产生样本放入培养基中，在30℃的温度下，培养45h。该采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，能够解决目前生产方法效率低，成本较高，不能满足生产需求的问题。CN109971814ACN109971814A权利要求书1/2页1.一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：取保存好的金色分支杆菌接种在PDA平板上，30℃下培养3d，待金色分支杆菌长满平板后，将5mL无菌0.1mol/L的Tritonx-100注入平板，轻摇使金色分支杆菌孢子均匀分散取，于30℃恒温培养36h；S2：将步骤S1中培养36h后的金色分支杆菌平板置于无菌紫外灯下照射处理，照射强度为285.8W/c㎡，照射时间为5-15min，然后将处理过的平板在光照下30℃培养36h，取出样本；S3：将步骤S2中培养后的产生样本放入培养基A中，在30℃的温度下，培养45h，所述的培养基A通过牛肉浸膏0.4g、氨基酸1.2g和无机盐0.5g混合搅拌5min，再加入琼脂2g搅拌2min，静置10min所制备；S4：将步骤S3中所得到菌株作为出发菌株，采用常压温室等离子(ARTP)诱变技术对出发菌株的单细胞悬浮液进行诱变处理，然后依据H+依赖型脱氧酶缺失型方法进行初步筛选，通过摇瓶进行复筛得到变异金色分支杆菌；S5：将步骤S4中所得到变异金色分支杆菌进行去核处理，将全基因合成的DNA生物酶基因片段孕烯醇酮提取到去核的变异金色分支杆菌中，构建产孕烯醇酮的金色分支杆菌；S6：将步骤S5中所得到的金色分支杆菌置于培养基B中，在光照环境下30℃培养36h，对金色分支杆菌进行加工，洗出孕烯醇酮与粗产物,所述的培养基B通过牛肉膏3g，蛋白胨10g，无机盐5g，葡萄糖15g，琼脂16g，加水1L,混合搅拌均匀，静置10min所制备。2.根据权利要求1所述的一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述步骤S5中的全基因合成的DNA生物酶基因片段孕烯醇酮提取包括以下步骤：B1：首先将含有孕烯醇酮的组织块进行材料处理；B2：对经过B1处理过的孕烯醇酮组织块进行培养细胞处理；B3：对经过B2处理的细胞液进行DNA提取。3.根据权利要求2所述的一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述B1步骤中对将含有孕烯醇酮的组织块进行材料处理时，先取含有孕烯醇酮的组织块0.3-0.5cm3，将其剪碎，加TE缓冲溶液0.5ml再转移到匀浆器中匀浆，取匀浆液转移到1.5mL离心管中，加入20％SDS25mL,蛋白酶，再对其进行60℃水浴1h。4.根据权利要求3所述的一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述B2步骤中对经过B1处理过的孕烯醇酮组织块进行培养细胞处理时，先对经过B1步骤处理后的细胞液常温静止悬浮后，用TBS缓冲液洗一次，再离心4000g×5min，去除上清液，然后加10倍体积的裂解缓冲液，最后在50℃水浴1h。5.根据权利要求4所述的一种采用金色分枝杆菌制备孕烯醇酮的方法，其特征在于：所述B3步骤中对经过B2处理的细胞液进行DNA提取时，先对经过B2处理后的细胞液中加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5mL离心管中，加等体积饱和酚溶液，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管，加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10m