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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116023505A(43)申请公布日2023.04.28(21)申请号202211010185.5C12N15/70(2006.01)(22)申请日2022.08.23A61K39/04(2006.01)A61K9/107(2006.01)(71)申请人兰州大学A61K47/18(2006.01)地址730000甘肃省兰州市城关区天水南A61K47/28(2006.01)路222号A61P31/06(2006.01)(72)发明人曹倩倩牛红霞祝秉东王燕琴雒艳萍何朴王娟米友军李菲(74)专利代理机构北京兴智翔达知识产权代理有限公司11768专利代理师张显益(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C07K1/30(2006.01)C12N15/62(2006.01)权利要求书2页说明书8页序列表(电子公布)附图4页(54)发明名称结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE及制备方法和应用(57)摘要本发明公开了结核分枝杆菌融合蛋白BfrB‑GrpE及制备方法和应用,该结核分枝杆菌融合蛋白BfrB‑GrpE,由结核分枝杆菌复制和休眠期免疫优势抗原BfrB和休眠期免疫优势抗原GrpE联合构建而成;本发明利用基因工程技术,成功构建、表达和纯化了不带有任何标签的结核分枝杆菌融合蛋白BG,解决了融合蛋白所带有的标签可能会影响到动物实验以及后期临床试验的后续问题,并且通过盐析与疏水层析相结合的方法使该无标签融合蛋白得到了有效的纯化;而且其具有表达产量高,表达稳定,对温度及盐离子浓度不敏感且在上清表达等优点,能进行工业发酵;本发明中的新型融合蛋白BG和佐剂联合构建结核亚单位疫苗诱导了偏向Th1型细胞免疫反应。CN116023505ACN116023505A权利要求书1/2页1.结核分枝杆菌融合蛋白BfrB‑GrpE,其特征在于:由结核分枝杆菌复制和休眠期免疫优势抗原BfrB和休眠期免疫优势抗原GrpE联合构建而成,氨基酸序列为:MTEYEGPKTKFHALMQEQIHNEFTAAQQYVAIAVYFDSEDLPQLAKHFYSQAVEERNHAMMLVQHLLDRDLRVEIPGVDTVRNQFDRPREALALALDQERTVTDQVGRLTAVARDEGDFLGEQFMQWFLQEQIEEVALMATLVRVADRAGANLFELENFVAREVDVAPAASGAPHAAGGRLGGGGSGGGGSGGGGSVTDGNQKPDGNSGEQVTVTDKRRIDPETGEVRHVPPGDMPGGTAAADAAHTEDKVAELTADLQRVQADFANYRKRALRDQQAAADRAKASVVSQLLGVLDDLERARKHGDLESGPLKSVADKLDSALTGLGLVAFGAEGEDFDPVLHEAVQHEGDGGQGSKPVIGTVMRQGYQLGEQVLRHALVGVVDTVVVDAAELESVDDGTAVADTAENDQADQGNSADTSGEQAESEPSGS。2.结核分枝杆菌融合蛋白BfrB‑GrpE的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:一、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB‑GrpE的构建二、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB‑GrpE小批量表达三、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB‑GrpE发酵表达四、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB‑GrpE的工业化发酵五、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB‑GrpE的纯化。3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌融合蛋白BfrB‑GrpE的制备方法,其特征在于:所述步骤一具体为:设计BfrB‑GrpE融合基因,两个基因之间加linker,翻译成氨基酸序列为:MTEYEGPKTKFHALMQEQIHNEFTAAQQYVAIAVYFDSEDLPQLAKHFYSQAVEERNHAMMLVQHLLDRDLRVEIPGVDTVRNQFDRPREALALALDQERTVTDQVGRLTAVARDEGDFLGEQFMQWFLQEQIEEVALMATLVRVADRAGANLFELENFVAREVDVAPAASGAPHAAGGRLGGGGSGGGGSGGGGSVTDGNQKPDGNSGEQVTVTDKRRIDPETGEVRHVPPGDMPGGTAAADAAHTEDKVAELTADLQRVQADFANYRKRALRDQQAAADRAKASVVSQLLGVLDDLERARKHGDLESGPLKSVADKLDSALTGLGLVAFGAEGEDFDPVLHEAVQHEGDGGQGSKPVIGTVMRQGYQLGEQVLRHALVGVVDTVVVDAAELESVDDGTAVADTAENDQADQGNSADTSGEQAESEPSGS*下划线为linker将pET30a(