腺嘌呤脱氨酶、包含其的腺嘌呤碱基编辑器及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115772512A(43)申请公布日2023.03.10(21)申请号202111044206.0(22)申请日2021.09.07(71)申请人华东师范大学地址200241上海市闵行区东川路500号申请人上海邦耀生物科技有限公司(72)发明人陈亮李大力张舜薛念念刘明耀(74)专利代理机构上海弼兴律师事务所31283专利代理师王卫彬黄益澍(51)Int.Cl.C12N9/78(2006.01)C12N15/55(2006.01)C12N9/22(2006.01)C12N15/62(2006.01)C12N15/85(2006.01)权利要求书2页说明书13页序列表11页附图7页(54)发明名称腺嘌呤脱氨酶、包含其的腺嘌呤碱基编辑器及其应用(57)摘要本发明公开了一种腺嘌呤脱氨酶、包含其的腺嘌呤碱基编辑器及其应用。所述腺嘌呤脱氨酶在包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第29位、第84位、第108位和第145位发生一种或多种氨基酸突变。本发明的腺嘌呤碱基编辑器包括核酸酶和所述的腺嘌呤脱氨酶，可有效破坏腺嘌呤脱氨酶与底物碱基的非特异性结合，将编辑窗口缩窄至1～2个碱基，同时维持较高的编辑活性；突变引起的结构口袋变化也使得腺嘌呤脱氨酶无法将胞嘧啶识别为底物，最终完全消除了ABE中存在的独立胞嘧啶编辑事件；并且保持较低的indel，提高了安全性，可促进其在精准医疗、动物疾病模型制作、作物遗传育种等方面的应用，具有极大的应用价值。CN115772512ACN115772512A权利要求书1/2页1.一种腺嘌呤脱氨酶，其特征在于，所述腺嘌呤脱氨酶在包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第29位、第84位、第108位和第145位发生一种或多种氨基酸突变。2.如权利要求1所述的腺嘌呤脱氨酶，其特征在于，所述一种或多种氨基酸突变包括：第108位氨基酸残基N突变为Q；或，第145位氨基酸残基L突变为T；或，第145位氨基酸残基L突变为Q；或，第84位氨基酸残基F突变为T；或，第84位氨基酸残基F突变为T，并且第108位氨基酸残基N突变为Q；或，第108位氨基酸残基N突变为Q，并且第145位氨基酸残基L突变为T；或，第108位氨基酸残基N突变为Q，并且第29位氨基酸残基P突变为M；或，第108位氨基酸残基N突变为Q，并且第29位氨基酸残基P突变为W；较佳地，所述腺嘌呤脱氨酶还包括核定位信号序列；所述核定位信号序列优选如SEQIDNO:3所示。3.一种腺嘌呤碱基编辑器，其特征在于，所述腺嘌呤碱基编辑器包括核酸酶和如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶；较佳地，所述核酸酶为Cas蛋白及其变体；更佳地，所述Cas蛋白为酿酒酵母来源的spCas9、金黄色葡萄球菌来源的SaCas9、毛螺菌科细菌来源的LbCas12a或酸胺球菌属细菌来源的enAsCas12a；所述Cas蛋白变体为VQR‑spCas9、VRER‑spCas9、spRY、spNG、SaCas9‑KKH或SaCas9‑NG。4.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶；较佳地，所述融合蛋白还包含核酸酶，所述核酸酶为如权利要求3所述的腺嘌呤碱基编辑器中的核酸酶。5.一种腺嘌呤碱基编辑系统，其特征在于，其包括：sgRNA和如权利要求3所述的腺嘌呤碱基编辑器；较佳地，所述sgRNA的靶序列如SEQIDNO:4～15的核苷酸序列所示。6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶、如权利要求3所述的腺嘌呤碱基编辑器、如权利要求4所述的融合蛋白或者如权利要求5所述的腺嘌呤碱基编辑系统。7.一种非治疗目的的碱基编辑方法，其特征在于，所述碱基编辑方法包括：在靶细胞中表达如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶、如权利要求3所述的腺嘌呤碱基编辑器、如权利要求4所述的融合蛋白或者如权利要求5所述的腺嘌呤碱基编辑系统，使所述靶细胞发生碱基编辑；较佳地，所述靶细胞的来源为分离的细胞系；更佳地，所述分离的细胞系为293T细胞、HELA细胞、U2OS细胞、NIH3T3细胞或N2A细胞。8.如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶、如权利要求3所述的腺嘌呤碱基编辑器、如权利要求4所述的融合蛋白或者如权利要求5所述的腺嘌呤碱基编辑系统在制备碱基编辑的药物或制备基因治疗的药物中的应用。9.如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶、如权利要求3所述的腺嘌呤碱基编辑器、如权2CN115772512A权利要求书2/2页利要求4所述的融合蛋白或者如权利要求5所述的腺嘌呤碱基编辑系统在构建动物模型和农作物育种中的应用。10.如权利要求1或2所述的腺嘌呤脱氨酶、如权利要求3所述的腺嘌呤碱基编辑器、如权利要求4所述的融