一种生物催化合成芳香化合物的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927489A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211325057.X(22)申请日2022.10.27(71)申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号(72)发明人陶飞吴雨桐许平(74)专利代理机构上海旭诚知识产权代理有限公司31220专利代理师郑立(51)Int.Cl.C12P7/42(2006.01)C12P7/24(2006.01)C12P7/22(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12R1/19(2006.01)权利要求书2页说明书9页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称一种生物催化合成芳香化合物的方法(57)摘要本发明公开了一种生物催化合成芳香化合物的方法，涉及芳香化合物的合成领域，所述方法利用底物通过全细胞反应液催化合成芳香化合物；底物为丁香酚或丁香油，全细胞反应液含有基因工程大肠杆菌；基因工程大肠杆菌由重组质粒构建；芳香化合物为阿魏酸和\或松柏醇和\或4‑乙烯基愈创木酚和\或香兰素。本发明提供的生物催化合成芳香化合物方法避免了辅因子的依赖，因而可以利用构建的全细胞催化体系或者高密度发酵转化木质素源的丁香油或丁香酚来高效合成多种高价值芳香化合物，极大的提高了生产效率，获得的香兰素产量是目前报道的以丁香酚为底物来生产香兰素的最大产量，具有重要的现实意义和工业应用价值。CN115927489ACN115927489A权利要求书1/2页1.一种生物催化合成芳香化合物的方法，其特征在于，所述方法利用底物通过全细胞反应液催化合成芳香化合物；所述底物为丁香酚或丁香油，所述全细胞反应液含有重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌由重组质粒构建；所述芳香化合物为阿魏酸和\或松柏醇和\或4‑乙烯基愈创木酚和\或香兰素。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1、合成催化酶基因并制备重组质粒；步骤2、利用步骤1得到的重组质粒构建所述重组大肠杆菌；步骤3、利用步骤2得到的重组大肠杆菌制备全细胞催化剂；步骤4、将步骤3得到的全细胞催化剂添加所述底物，进行发酵，得到发酵液；步骤5、从步骤4获得的发酵液中提取芳香化合物，并进行检测。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中所述步骤1中所述重组质粒包括重组质粒pETDuet‑ado‑pad，重组质粒pACYCDuet‑pvvaoA‑calAB以及重组质粒pACYCDuet‑psvaoA‑calAB；所述步骤2中所述重组大肠杆菌包括基因工程菌株Ecoli‑VCAD和基因工程菌株Ecoli‑SCAD；所述基因工程菌株Ecoli‑VCAD由所述重组质粒pETDuet‑ado‑pad以及所述重组质粒pACYCDuet‑pvvaoA‑calAB转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制得；所述基因工程菌株Ecoli‑SCAD由所述重组质粒pETDuet‑ado‑pad以及所述重组质粒pACYCDuet‑psvaoA‑calAB转化入所述大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制得。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法中所述重组质粒pETDuet‑ado‑pad包含所述芳香酚单加氧酶Ado和所述酚酸脱羧酶Pad基因片段；所述重组质粒pACYCDuet‑pvvaoA‑calAB包含所述香草醇氧化酶VaoA、所述松柏醇脱氢酶CalA、所述松柏醛脱氢酶CalB基因片段；所述pACYCDuet‑psvaoA‑calAB质粒包含所述芳香酚单加氧酶Ado和所述酚酸脱羧酶Pad基因片段。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述香草醇氧化酶VaoA的氨基酸序列如SEQIDNo.:1或SEQIDNo.:3所示，所述香草醇氧化酶VaoA的核苷酸序列如如SEQIDNo.:2或SEQIDNo.:4所示；所述松柏醇脱氢酶基因CalA的氨基酸序列如SEQIDNo.:5所示，所述松柏醇脱氢酶CalA的核苷酸序列如SEQIDNo.:6所示；所述松柏醛脱氢酶CalB的氨基酸序列如SEQIDNo.:7所示，所述松柏醛脱氢酶CalB的核苷酸序列如SEQIDNo.:8所示；所述芳香酚单加氧酶Ado的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，所述芳香酚单加氧酶Ado的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；所述酚酸脱羧酶Pad的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示，所述酚酸脱羧酶Pad的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述香草醇氧化酶VaoA来源于拟青霉菌PaecilomycesvariotiistrainCBS101075或者简青霉菌PenicilliumsimplicissimumCBS170.90；其中所述来源于拟青霉菌Pae