DNA的提取与鉴定实验报告.docx

DNA的提取与鉴定实验报告DNA的提取与鉴定实验报告在学习、工作生活中，需要使用报告的情况越来越多，报告具有成文事后性的特点。相信很多朋友都对写报告感到非常苦恼吧，下面是小编收集整理的DNA的提取与鉴定实验报告，欢迎大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。实验原理：根据成熟雌蟾蜍体内含大量卵细胞且可以方便获取，细胞内含核酸丰富，没有其它组织器官等的干扰等优点以确定蟾蜍卵细胞为实验所需的真核细胞。通过TRIZOL溶液中变性剂破碎真核细胞，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再利用RNA不溶于异丙醇的性质将自身析出，达到分离提纯的目的。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的`蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。甲基绿―吡罗红为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。当甲基绿与吡罗红作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；吡罗红与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而吡罗红则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色（但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色）。即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成绿色。09419实验材料：（一）试剂甲基绿―吡罗红染料：①染色剂A液的两种配制方法第一种方法：取吡罗红甲基绿粉1g，加入到100mL蒸馏水中溶解，然后用滤纸过滤，将滤液放入棕色瓶中备用。第二种方法：取甲基绿2g溶于98mL蒸馏水中，取吡罗红G5g溶于95mL蒸馏水中。取6mL甲基绿溶液和2mL吡罗红溶液加入到16mL蒸馏水中，即为A液，放入棕色瓶中备用。（注意：用于核酸染色的是吡罗红G，请不要错买吡罗红B。）②染色剂B液的配制方法B液是一种缓冲液，由乙酸钠和乙酸混合而成。先取乙酸钠16.4g，用蒸馏水溶解至1000mL备用；再取乙酸12mL，用蒸馏水稀释至1000mL备用。取配好的乙酸钠溶液30mL和稀释的乙酸20mL，加蒸馏水50mL，配成pH为4.8的B液（缓冲液）。③染色剂的配制染色剂是由A液、B液混合配制而成的。取A液20mL和B液80mL混合，就是实验中所用的吡罗红甲基绿染色剂。应该注意的是该试剂应现配现用。2.TRIZOL试剂（Invitrogen公司购买）3.75%乙醇4.氯仿5.异丙醇6.Nacl(0.14m/l)（二）器材1.离心机（3000r.p.m）2.冰浴3．研钵4.烧杯5.量筒6.试管7.玻棒8.胶头滴管9.离心管10.天平实验方法：制备匀浆：以班级为单位，称取大概10g蟾蜍卵细胞（2~3℃保存），于研钵（可置于冰浴锅上）中，根据10~30mg组织细胞加1mltrizol试剂的量加入其中，快速研磨，制备匀浆。实验二人合作为一组，每组取大概10ml匀浆。RNA的提取：取回匀浆后，室温静置10min，使样品充分裂解――离心(3000r.p.s)20mins――取上清液移至新的离心管――加1/5TRIZOL溶液体积氯仿――在手中反复振荡摇匀，室温静置10min。――离心20mins――取上清液――在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10min。――充分混匀，静置10minute――离心20min――沉淀用75%乙醇洗涤两次定性试验：取2支干净试管，一管加入1.5MLRNA溶液（将RNA颗粒状的沉淀溶于2ML0.14/NACL溶液中），另一管加入蒸馏水1.5ML,像两管中加入3M甲基绿-吡罗红染色剂，溶液变成红色为阳性反应。实验结果：利用TRIZOL法可成功提取的RNA，并使得甲基绿-吡罗红染色剂显红色。实验注意事项：TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。由于本科生实验室里的为普通离心机，转速不高，故可适当延长离心时间。离心后，注意上清液和沉淀的取舍以及对RNA层的小心吸取，否则将导致RNA样品中有DNA污染。