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DNA提取实验报告

生物学大实验（二）
实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验
实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的
实验原理介绍和实际操作，加深对分子生物学基本
技术的理解和掌握。
实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、
摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌
器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳
仪、超净工作台等。
实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真
菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实
现对质粒的扩增。经过处理的线状dna在外界环
境恢复正常的时候不能够复性而质粒dna可以
复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分
离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制
性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位
点上，并切割dna。当对提取的质粒dna进行电

泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要
比开环和线状分子的泳动速度快。
实验步骤：
一质粒扩增

（1）普通lb固体培养基制备：
制备lb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完
全冷却后，保存备用。

（2）将大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃振
荡培养过夜(200转/分)
二质粒dna的提取(碱法)
1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，
12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到
较多的细菌沉淀；
2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离
心管底部的液体流尽。

3、加入100μl用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，
将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。

4、加入200μl现配的溶液ii，盖紧管口，
轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免dna断
裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。

5、加入150μl预冷的溶液iii，盖紧管口，
温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于
溶液iii中，冰浴5分钟。
6、取上部水相，移入新的离心管，加入2倍
体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积
的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双
链dna，然后4℃，12000rpm离心10min。
7、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，
使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的1ml70
％乙醇。
8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使
液体流尽，置dna干燥5～10分钟。
9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体
流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。

10、将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水
（ph8.0）中，储于-20℃冰箱中
三dna酶切反应
1、将洁净干燥并经灭菌的eppendorf管
（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入dna
（υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液
2υl，将管内溶液混匀后加入0.5υl酶液，用手
指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一
下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败
的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时
应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。

2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于
适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃
水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。

3、每管加入2υl0.1mol/ledta
（ph8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存
备用。
四dna的琼脂糖凝胶电泳

1、取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至
1000ml，配成0.5×tbe稀释缓冲液，待用。
2、胶液的制备：称取3g琼脂糖置于1000ml
锥形瓶中，加入300ml0.5×tbe稀释缓冲液，
加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，
此为1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，
使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应
盖上封口膜，以减少水分蒸发。
3、胶版的制备：想冷却至50-60℃的琼脂
糖胶液中加入溴化乙锭（eb）溶液使其终浓度为
0.5υlg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固
不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待
胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝
胶，然后向槽内加入0.5υ×tbe稀释缓冲液至页
面恰好没过胶板上表面

4、加样：取20υl的酶解液与2υl10×载样
液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完
一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上

样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品槽底部的
凝胶刺穿
5、电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通
电源，控制电压保持在60-80v，电流在40ma以
上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止
电泳
6、观察和拍照
五实验结果
六实验结论
通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工
程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的结果。
结果显示，第三条中酶切效果良好，rna被降解
的很完全，第四根没有被酶切，质粒dna跟rna
同时