质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告.pdf

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定之宇文皓月创作一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操纵方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步调，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。PCR一次循环的具体反应步调为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差别：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保管在溶液中，染色体DNA不克不及复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会发生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种分歧的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8DNA纯净A260/A280<1.8暗示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8含RNA杂质，用RNA酶去除。4.质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操纵过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。5.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：分歧的DNA，分子量大小及构型分歧，电泳时的泳动率就分歧，从而分出分歧的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、资料与方法：（一）实验资料：1.PCR仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管资料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物2.质粒DNA的提取与制备仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管资料：溶液P1（S1）、溶液P2(S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α3.质粒DNA的定量（紫外分光光度法）仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪资料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ4.质粒DNA的酶切鉴定仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪资料：无菌水、10×M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统资料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液（二）实验方法1.PCR准备目的DNA：菌液煮沸10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水5.5μl、2*Premix将Taq12.5μlPCR反应管置台式离心机中瞬时离心、引物1(10mol/L)1μl、引物2(10mol/L)1μl、菌液将装有PCR反应体系的PCR反应管放入PCR仪上进行如下操纵：将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中2.质粒DNA的提取与制备①94℃预变性5分钟后开始以下循环②循环为94℃——30秒，50℃——30秒，72℃——1分钟。循环为30次③72℃5分钟④4℃保温取1.5ml培养物加