他克莫司检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CNCN102621299102621299B(45)授权公告日2014.10.22(21)申请号201210098330.X测全血他克莫司浓度的比较.《中国医院药学杂(22)申请日2012.04.06志》.2002,第22卷(第6期),“1.3试剂与仪器”和347页“2.1测试原理和程序”.(73)专利权人苏州博源医疗科技有限公司地址215000江苏省苏州市苏州高新技术产审查员贾静业开发区科灵路78号(72)发明人虞留明田军袁红霞蔡江丽(51)Int.Cl.G01N33/543(2006.01)G01N33/535(2006.01)(56)对比文件CN102368054A,2012.03.07,说明书第28段、第48-49段、第50-54段、58-59段.US2005/0176080A1,2005.08.11,说明书第4段、第19段、第28段、第33-37段，附图1-3.CN102095865A,2011.06.15,全文.US2009/0087865A1,2009.04.02,说明书第84-85段、147-148段.文爱东等.酶联免疫法与微粒子酶免疫法检权权利要求书2页利要求书2页说明书9页说明书9页附图1页附图1页(54)发明名称他克莫司检测方法(57)摘要本发明公开了一种他克莫司检测方法，包括以下步骤：将抗他克莫司特异性抗体包被在固相支持物上，加入待测样本和他克莫司酶标偶联物；使所述待测样本中他克莫司与所述他克莫司酶标偶联物竞争性地结合抗所述他克莫司特异性抗体；经固相ELISA洗涤步骤后，加入对应酶的底物显色，测量相应的吸光值，对照他克莫司ELISA检测标准曲线，获取待测样本中他克莫司的含量。本发明的检测方法，特异性强，可以准确的确定待测样本中是否存在他克莫司，同样可以准确地确定他克莫司的含量。CN102621299BCN10269BCN102621299B权利要求书1/2页1.一种他克莫司检测方法，其特征在于：包括以下步骤：将抗他克莫司特异性抗体包被在固相支持物上，加入待测样本和他克莫司酶标偶联物；使所述待测样本中他克莫司与所述他克莫司酶标偶联物竞争性地结合所述抗他克莫司特异性抗体；经固相ELISA洗涤步骤后，加入对应酶的底物显色，测量相应的吸光值，对照他克莫司ELISA检测标准曲线，获取待测样本中他克莫司的含量，其中，所述抗他克莫司特异性抗体由他克莫司免疫原免疫动物得到，所述他克莫司免疫原的结构式如(I)所示：式(I)式(I)中，R为N-O-(CH2)3-COO-，载体具有免疫原性，其选自牛血清白蛋白。2.根据权利要求1所述的他克莫司检测方法，其特征在于：所述他克莫司ELISA检测标准曲线的制备方法包括：(1)将他克莫司粉末溶解于甲醇溶液，制备成1mg/ml的储存液，用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml和0ng/ml的标准样品，其中，ELISA缓冲液含有50.0mMTris，145mMNaCl和0.25％的BSA；(2)将抗他克莫司特异性抗体包被在固相支持物上，加入所述标准样品和他克莫司酶标偶联物，使标准样品的他克莫司与他克莫司酶标偶联物竞争性地结合抗他克莫司特异性抗体，经固相ELISA洗涤步骤后，加入对应酶的底物显色，测量相应的吸光值；(3)以各标准样品中他克莫司的吸光值和他克莫司含量为坐标获取他克莫司ELISA检测标准曲线。3.根据权利要求1所述的他克莫司检测方法，其特征在于：所述步骤包括：用PBS将上述抗他克莫司特异性抗体稀释成1∶1000-1∶10000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h；用PBS将上述包被有所述抗他克莫司特异性抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的0.5％的BSA溶液，4℃封闭放置8-16h，然后用PBS洗涤3次，加入20μL/孔的标准品，再加入100μL/孔工作浓度的他克莫司衍生物酶标偶联物；室温下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入100μLTMB底物，室温孵育30min再每孔加入100μL2M硫酸。4.根据权利要求3所述的他克莫司检测方法，其特征在于：所述他克莫司衍生物酶标偶联物中酶包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。5.据权利要求4所述的他克莫司检测方法，其特征在于：所述他克莫司衍生物酶标偶联物的制备方法包括：2CN102621299B权利要求书2/2页(1)制备酶溶液：将酶在室温条件下溶解于磷酸缓冲液中，终浓度为2-10mg/mL；(2)使具有式(III)中结构的他克莫司衍生物活化及偶联物的合成：用有机溶剂溶解具有式(III)中结