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本发明公开了一种分离纯化甘露二糖和甘露三糖的方法,涉及化合物的分离和提纯工艺。本发明对含2?10糖的低聚甘露糖混合溶液先采用超滤的方式获得主要含1?6糖的混合液,再纳滤后纳滤液中主要含甘露二糖和甘露三糖,4?6糖主要以聚合形式存在,且含量低。通过氨基柱过滤纳滤液,第一峰段为甘露四糖?甘露六糖的混合液,第二峰段为甘露三糖,第三峰段为甘露二糖。收集第二峰段和第三峰段的洗脱液,进行真空干燥,可获得高纯度的甘露二糖和甘露三糖,纯度可达到95%以上。本发明方法为获得高纯度的甘露二糖和甘露三糖开辟了新途径,且公开的方法操作简单、成本低、可连续化生产,适用于工业化大规模生产。