一种甘露糖固定化细胞的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109593752A(43)申请公布日2019.04.09(21)申请号201811537531.9C12R1/19(2006.01)(22)申请日2018.12.15(71)申请人大连民族大学地址116600辽宁省大连市经济技术开发区辽河西路18号(72)发明人王剑锋鲁晓莉刘宝全李春斌(74)专利代理机构大连智高专利事务所(特殊普通合伙)21235代理人胡景波(51)Int.Cl.C12N11/14(2006.01)C12N11/10(2006.01)H01F1/00(2006.01)H01F1/42(2006.01)H01F41/00(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图3页(54)发明名称一种甘露糖固定化细胞的方法(57)摘要一种甘露糖固定化细胞的方法，属于细胞固定领域。该固定方法以大肠杆菌悬浮液为固定对象，选择了不用反应温度、反应时间以及不同pH的缓冲液对大肠杆菌悬浮液的固定效果，最终确定最优条件。本发明使用简单的糖基蛋白识别原理，在固定化细胞过程中不使用戊二醛、甲醛等双功能试剂，成本较低，且反应过程温和，同时使细胞载量升高，且能够较大程度保持细胞的活性，提高细胞活性回收率。CN109593752ACN109593752A权利要求书1/1页1.一种甘露糖固定化细胞的方法，其特征在于，该方法以甘露糖磁性纳米颗粒作为固定材料，将悬浮液浓度为4.5～25.5mg/mL的大肠杆菌细胞悬浮液在温度为4～50℃的条件下加入缓冲液后进行反应0.25～3h。2.根据权利要求1所述的一种甘露糖固定化细胞的方法，其特征在于，所述的缓冲液为pH为6.0-8.0的磷酸盐缓冲液、pH为9.0的Tris-HCl缓冲液或pH为10.0-11.0的甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种。3.根据权利要求2所述的一种甘露糖固定化细胞的方法，其特征在于，所述的缓冲液为pH为6.0-8.0的磷酸盐缓冲液的盐浓度为10～250mM。4.根据权利要求1所述的一种甘露糖固定化细胞的方法，其特征在于，所述的甘露糖磁性纳米颗粒的制备方法如下：所述的甘露糖磁性纳米颗粒的制备方法如下：(1)将FeSO4·4H2O和FeCl3·6H2O按照摩尔比1：3溶于蒸馏水中，然后转移至三颈圆底烧瓶中，在80℃，搅拌和氮气保护条件下，迅速加入40％的NH4OH调节溶液至碱性，反应5min后，加入油酸，再搅拌反应25min后，获得的黑色沉淀用无水乙醇和超纯水反复清洗至上清液无色透明，强磁铁沉淀分离，于真空烘箱中烘干，得到油酸磁性纳米颗粒；(2)称取一定量的多巴胺盐酸盐溶解于缓冲溶液中，配制成3mg/mL的多巴胺盐酸溶液，将步骤(1)制备的油酸磁性纳米颗粒研磨均匀加入到多巴胺盐酸溶液中，超声15min，然后置空气中搅拌8h，搅拌结束后，用磁铁分离，获得的深棕色沉淀用乙醇和蒸馏水清洗，于真空烘箱中烘干，得到磁性纳米颗粒称为多巴胺功能化磁性纳米载体；(3)称取一定量的甘露糖胺盐溶解于缓冲溶液中，配制成3mg/mL的甘露糖胺盐溶液，将步骤(2)制备的多巴胺功能化磁性纳米颗粒研磨均匀加入到甘露糖胺盐溶液中，然后置空气中搅拌5h，搅拌结束后，用磁铁分离，获得的黑色沉淀用乙醇和蒸馏水清洗，于真空烘箱中烘干，得到磁性纳米颗粒称为甘露糖磁性纳米载体。2CN109593752A说明书1/4页一种甘露糖固定化细胞的方法技术领域[0001]本发明涉及一种固定化细胞的方法，具体涉及一种甘露糖固定化细胞的方法，属于细胞固定领域。背景技术[0002]全细胞已经广泛应用于各领域的功能检测，例如生物催化(参见：Z.-J.Zhangetal.,2013)、环境检测(H.Ben-Yoavetal.,2009)、药理学(K.Setal.,2008)以及食品工业(K.Gaoetal.,2009)等。同时，全细胞作为微型反应器拥有所有必须的辅因子和酶，因此，它们经常用作制备药物中间体，有价值化学品的生物催化剂(K.Nietal.,2012)。但游离细胞在培养基或者反应溶液中不稳定，不易连续使用，且对反应环境有较高的要求(参见：S.Yuetal.,2016)。通过固定化获得稳定的细胞，则可实现重复使用，且在生物反应器中可获得极高的菌体浓度，降低使用成本，容易回收，操作简便(G.Rehnetal.,2013)。[0003]传统的固定化技术包括物理吸附(P.Kilonzoetal.,2011)、截留(K.Adinarayanaetal.,2005)、交联(Y.-W.Zhangetal.,2010)以及共价固定(K.Nietal.,2012)。其中，由于结合过程温和，采用物理吸附对细胞活性损失较小，但是由于吸附作用力微弱，导致细胞易从固定载体表面脱落(H.Gu