荧光探针定量PCR技术原理及应用样本.doc

荧光探针定量PCR技术原理及应用PCR技术是通过对基因选取性片段进行体外高效扩增，实现目基因检测。荧光探针定量PCR（FQ-PCR）是一种新基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（realtimequantitativePCR）”或“TaqManPCR(以美国PE公司商标命名)”。该技术是在常规PCR基本上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目基因准拟定量检测，正发展成为临床实验诊断常规技术。1.原理FQ-PCR工作原理[1-3]是运用Taq酶5’→3’外切酶活性，在PCR反映系统中加入一种荧光标记探针。该探针可与引物包括序列内DNA模板发生特异性杂交，探针5’端标以荧光报告基团FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），接近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递构造。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出荧光信号被3’端淬灭基因吸取或抑制，不浮现荧光信号变化。当PCR反映体系中有目基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会依照碱基配对原理与之杂交。当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合位置时，其5’→3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间能量传递构造被破坏，淬灭基团淬灭作用被解除，荧光报告基团荧光信号释放出来（图1）。PCR反映每复制一种特异核酸片段，就有一种探针被切断，随着一种荧光信号释放。由于被释放荧光基团数目和PRC产物是一对一关系，因而用荧光检测技术检测出荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪器实时检测(图2)，为新PCR定量原理创造了条件。图1.TaqManPCR反映模式（A）聚合反映：（B）链置换；（C）裂解；（D）聚合完毕（R：FAM；Q：TAMRA；FP：上游引物；RP：下游引物）图2.FQ-PCR实时动力学曲线ABI公司一方面依照上述原理研制了ABI7700等系列定量PCR仪，在PCR反映中设立原则模板系列（普通5~7个原则浓度）反映管和空白对照管。通过实时检测反映管中荧光信号，计算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表样品管荧光报告基团发光强度与淬灭基团发光强度比率，RQ-代表空白管中两者比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量。当荧光信号增强到某一阈值（依照荧光信号基线平均值和原则差，计算出以99.7%置信度不不大于平均值作为阈值）时，原则模板反映管所用循环次数（Ct值）就被记录下来。Ct值与原则模板数量对数值之间有严格线性关系[3]，运用系列原则模板Ct值，制成原则曲线(图3)，依照待测样品Ct值，就可在原则曲线中拟定待测样品起始DNA数量。依照数据解决，即可得出定量成果。探针设计普通应符合如下条件[2]：①探针长度应在20~40个碱基左右，以保证结合特异性。②GC碱基含量在40%~60%，避免单核苷酸序列重复。③避免与引物发生杂交或重叠。④探针与模板结合稳定限度要不不大于引物与模板结合稳定限度，因而探针Tm值要比引物Tm值至少高出5℃。此外，探针浓度，探针与模板序列同源性，探针与引物距离都对实验成果有影响。图3.FQ-PCR原则曲线2.技术特点2.1封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致假阳性老式PCR于反映结束后取出反映液，通过电泳染色和紫外仪观测成果。扩增产物在开放状态下分析，对实险室污染是不可避免。因污染而导致假阳性，成为PCR临床实验诊断技术应用一种难以逾越障碍。FQ-PCR在全封闭状态下实现PCR扩增和产物分析，完全杜绝了扩增产物污染而导致假阳性。至于样品间污染，无论从目基因数量、浓度还是颗粒大小分析，都比较容易控制。国内PCR临床应用浮现问题，产物污染所致假阳性是重要因素之一。2.2基因定量检测，扩展了临床应用空间老式PCR对基因检测只能定性，不能定量重要是由扩增产物积累动力学所决定：①PCR产物在扩增过程中呈指数积累，当产物增长到一定限度，产物就停止了指数积累。不同起始模板，其指数增长期所用循环是不同，因而，不同数量基因样品在同一循环次数中积累产物不能作为样品基因定量根据；②PCR产物积累到一定限度就不能再增长，再进入平台期。为了扩大PCR检出敏捷度普通要增长循环次数，循环次数增长使得样品目基因含量高反映管已进入平台期，终产物量并不代表样品目基因含量；③PCR反映管间扩增效率差别总是存在，既然PCR产物呈指数增长，由扩增效率差别引起产物扩增差别也呈指数积累，增长循环次数势必增长终产物差别，而减少循环次数又减少了检测敏捷度。FQ-PCR采用实时