荧光定量PCR的原理及应用.pptx

荧光定量PCR仪的应用PCR的反应过程实时荧光定量PCR中的三个概念域值：PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。Ct值与起始模板的关系每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，CT值越小；模板DNA的起始拷贝数越少，CT值越大。一般正常的CT值范围在15-35之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。SYBRGreen®IMeltCurveAnalysis优点：对目标序列有很高的特异性，在病原微生物特异性检测上有独特优势设计简单，准确性好缺点：只适合于一种特异目标的检测，相对价格略高引物设计的一般原则：产物长度在80-300bp之间产物GC含量在50-60%之间引物的GC含量在50-60%之间，熔解温度在55-65℃之间应避免引物中有连续的G或C，但推荐在引物的末端含有G或CPrimer5.0.idtdna./Scitools/Applications/PrimerQuest/Default.aspx?SequenceWarning=True荧光定量PCR实验技术路线定量方法绝对定量比较CT法（△△CT）前提：每个循环增加一倍的产物数量，靶基因和看家基因的扩增效率基本一致双标准曲线法利用两组标准曲线分别得到目的基因及持家基因的表达量样本目的基因表达量=相对定量方法二——双标准曲线法实时荧光定量PCR增长曲线反映荧光强度与循环数的对应关系Ct值Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。荧光定量PCR标记方法内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特异性探针Amplifluor(Intergen)熔解温度(Tm值)荧光定量PCR实验技术路线荧光定量PCR实验技术路线荧光定量PCR实验技术路线相对定量——在一定样本中靶基因相对于另一参照样本的量的变化目标基因与持家基因扩增效率差别举例谢谢!