实时荧光定量PCR技术的原理及应用.doc

实时荧光定量PCR技术的原理及应用————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：个人收集整理勿做商业用途个人收集整理勿做商业用途个人收集整理勿做商业用途实时荧光定量PCR技术的原理及应用（图)一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量?通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析。4、几个概念:（1)扩增曲线:（2)荧光阈值：(3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理:理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0（1+Ex）nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C（t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记:二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一:SYBRGreen法（一)工作原理1、SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开,无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。PCR反应体系的建立及优化:1、SYBRGreen使用浓度：太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度：可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer体系的优化5、反应温度和时间参数：由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同(二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价;可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物.（三）优点及缺点优点:对DNA模板没有选择性;适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针;非常灵敏；便宜。缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高.方法二：TaqMan———水解型杂交探针*＊5′端标记有报告基团(Reporter,R),如FAM、VIC等*＊3′端标记有荧光淬灭基团（Quencher，Q)＊*探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光＊＊Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性,可水解探针（一)工作原理注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：1、引物、探针的设计：探针Tm为68—70℃，〈30bp，5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针,扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为:94℃,10-20S60℃,30-60S(Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，3、优化引物和探针浓度:获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值引物浓度:50—900nM探针浓度：50—250nM4、其他与常规PCR相同（二）优缺点优点：对目标序列的高特异性----—-阴性结果确定设计相对简单-----—与目标序列某一区域互补重复性比较好缺点:只适合一个特定的目标;委托公司标记，价格较高;不易找到本底低的探针