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本发明涉及一种脱细胞液、脱细胞基质水凝胶及其制备方法和应用,该脱细胞液包括以下终浓度的组分:NaCl或NH4Cl,1?5mol/L;脱氧胆酸钠,1%?10%;DMSO,0.5?5%;磷酸三丁酯,0.1%?5%;甘氨酸,0.01?0.5mol/L;溶剂为水。脱细胞基质水凝胶的制备方法包括:将收集的组织块进行预处理;将步骤1获得的组织块剪切后置于上述脱细胞液中搅拌处理,得到脱细胞支架;将所述脱细胞支架清洗后冻干,冻干后研磨成基质粉末;将所述基质粉末用消化液消化,获得预凝胶;滤除所述预凝胶未消化的杂质,然后调节pH至6.5?7.5,即得。采用本发明的脱细胞基质水凝胶进行类器官培养,与类器官组织及细胞具有良好的生物相容性,并且具有较好的组织修复效果,可以更好地与细胞亲和,有利于3D培养的细胞存活与增殖。