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本发明公开一种不同粒径球形硅胶色谱填料的制备方法及应用。该球形硅胶色谱填料的制备方法,包括如下步骤:步骤一、将硅溶胶水溶液溶于含有酚和醛的水溶液中,加入与水互溶的有机溶剂得到硅溶胶溶液,将所述硅溶胶溶液用无机酸调节Ph值,再将所述硅溶胶溶液静置,得到酚醛树脂和硅胶的复合微球;步骤二、将所述酚醛树脂和硅胶的复合微球用水和乙醇反复洗涤3?6次;步骤三、通过马弗炉高温煅烧的方式得到不同粒径的球形硅胶色谱填料。本发明可以通过不同粒径的硅溶胶作为硅源,可控的制备出不同粒径的硅胶微球色谱填料。只需静置硅溶胶溶液1?4小时,可以快速地制备硅胶复合微球,提高球形硅胶色谱填料的制备效率。