透射电镜样品制备方法.doc

透射电镜样品制备方法由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。此外还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm*1mm。也可将组织修成1mm*1mm*2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。操作最好在低温（0℃~4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。取材部位要准确。取材方法将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。如果组织块带有较多的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定。动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2~3mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）2-4小时或以上。*固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签送至电镜室。体外培养细胞的取材（在冰浴上进行）培养在培养瓶中的细胞取材时，先倒出部分培养液，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将细胞悬液转移到离心管中，离心机4℃低速离心（2000转/分）10分钟，使细胞聚成团块，弃去上清，沿壁小心加入新鲜的固定液，保持细胞成团状态，于4℃冰箱中固定2小时以上。*固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签送至电镜室。对于血液及其他细胞悬浮液，不宜直接固定，可在取材后将其放入离心管，以2000-4000转/分的速度离心10-15分钟，待样品在离心管底部集结成团块状后，用吸管吸出上清液，再缓缓滴入固定液稍加固定，然后用刮铲将样品取出并切割成小块，再行固定。植物组织取材植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不像动物细胞那么迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透，因此，植物材料的取材宜切成薄片状或牙签状，经适当的固定后再切成小方块。*固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签送至电镜室。细菌及藻类等样品取材对于不易成团的样品，需先清洗，加入固定液后吹散，于4℃冰箱中固定2小时，固定结束后，PBS清洗3次，继续按照文献《琼脂铸模法制备透射电镜样品》（白焕红）内描述方法进行琼脂预固定。再将琼脂预包埋后的样品于4℃冰箱中固定过夜。*固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。送样前请用PBS浸泡清洗3次，贴好标签送至电镜室。缓冲液配方磷酸盐缓冲液（三个步骤）磷酸盐缓冲液（0.2M）甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液Na2HPO42H2O35.61g(Na2HPO47H2O)53.65g(Na2HPO412H2O)71.64gNaH2PO4H2O27.60g(NaH2PO42H2O)31.21g加蒸馏水溶解成1000ml加蒸馏水溶解成1000ml2.按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液0.2M磷酸盐缓冲液的配制pH6.46.66.87.07.27.47.67.88.0甲液(ml)乙液(ml)26.573.537.562.549.051.061.039.072.028.081.019.087.013.091.58.594.75.33.将溶液用蒸馏水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。