何首乌苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析.docx

何首乌苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析【摘要】目的克隆何首乌苯甲酮合成酶基因并作序列分析。方法以何首乌PolygonummultiflorumThunb.为材料，根据其它植物苯甲酮合成酶(Benzalacetonesynthase，BAS)基因cDNA序列的保守区域设计引物，利用RTPCR和3`RACE，克隆其基因。结果从何首乌叶cDNA中克隆出了长度为1049bp的基因片段。序列分析表明该片段具有典型的CHS基因家族的结构域，为何首乌的BAS基因片段，命名为PmBAS。将得到的序列提交GenBank，序列号为FJ601686。对获得的PmBAS的氨基酸序列进行比较分析，发现PmBAS不含有Phe215，这种差异可能是CHS与BAS催化不同反应的重要原因之一。何首乌BAS与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明，其与同为蓼科的虎杖和掌叶大黄的同源性较近。结论对利用基因工程技术促进何首乌蒽醌合成具有重要意义。【关键词】何首乌；苯甲酮合成酶；基因克隆；序列比较蒽醌是一类重要的中草药活性成分，常见于何首乌、决明、大黄、虎杖、芦荟和茜草等植物中，具有抗菌、泻下、利尿、抗氧化和过氧化作用、抗诱变和保肝等多种功效［1，2］。Dewick等［3］与VELIEK等［4］认为，蒽醌的合成大致分为3个阶段：①以乙酰辅酶A为起始单元，连续与8个丙二酸单酰辅酶A发生缩合，引入8个二碳单位，最后生成蒽醌的基本骨架——八酮化合物；②八酮化合物经过还原、脱羧及氧化等步骤，形成大黄酚、芦荟大黄素与大黄酸等蒽醌类化合物；③八酮化合物经过水解、脱羧、脱水与甲基化等步骤，形成大黄素与大黄素甲醚等蒽醌类化合物。在第1阶段中，催化乙酰辅酶A与丙二酸单酰辅酶A缩合的反应是由植物查尔酮合成酶系催化完成的。查尔酮合成酶系属于植物Ⅲ型聚酮合成酶的一个家族，包括了查尔酮合成酶、芪合成酶、吡喃酮合成酶、苯甲酮合成酶、吖啶酮合成酶和芦荟松合成酶等成员，它们的氨基酸序列相似性达60%～70%［5，6］。近几年来，一系列功能不同的查尔酮合成酶系不断从蓼科植物中被克隆和鉴定。如Abe等［5］从蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumLinn.中克隆得到CHS与BAS。CHS能催化3分子的丙二酸单酰辅酶A和1分子对香豆酰辅酶A结合形成查尔酮。BAS能催化1分子pcoumaroyl辅酶A与1分子的丙二酸单酰辅酶A，缩合生成具有抗炎作用的苯乙烯基丙酮。Junghanns等［7］也从掌叶大黄中克隆得到ALS，能够催化6分子的乙酰辅酶A，形成芦荟松。Samappito［8］等也从园叶大黄Rheumtataricum中克隆得到STS。何首乌PolygonummultiflorumThunb.，蓼科传统中药，具有补肝肾、益精血、乌须发、生发、强筋骨之功效，主要含蒽醌、二苯乙烯苷类化合物和卵磷脂等活性成分［1，2］。我们以何首乌为材料，采用RTPCR技术克隆其BAS基因，并进行序列分析。这对从分子水平上探讨蒽醌的生物合成机制中具有重要的指导意义，并为下一步利用转基因技术来提高何首乌蒽醌产量的研究奠定基础。1材料与试剂植物材料何首乌PolygonummultiflorumThunb.采自西南大学峨眉校区。Taq酶、限制性内切酶、分子量Marker为Takara产品；DNA电泳凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；其余试剂均为上海生工生物工程公司产品。2方法总RNA的提取剪取何首乌幼嫩的叶片，加液氮研磨成粉末，RNA的提取使用Tiangen公司的RNAplant植物总RNA提取试剂，具体步骤按说明书进行。cDNA的获得以纯化的RNA为，以oligo(dT)18:5`GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)183`为反转录引物，采用AMV反转录酶进行反转录获得cDNA。引物设计与合成根据Genbank所报道的已知植物的BAS基因的cDNA序列，使用PrimerPremier引物设计，由上海英俊生物技术服务有限公司合成所有引物，序列中间片段引物，正向引物(P1)：5′GAATGGGGCCAACCC(T)AAGTC3′；反向引物(P2)：5′CCATAG(C)TCGTTCAACACTTG3′。3`RACE引物，3P1：5′TGTCCAAGACTCTTCCCGTAC3′；3P2：5′TATCCTGGACCATGTTGAAGC3′。PCRPCR扩增采用BioRAD公司的MG96G梯度PCR仪，反应条件按引物的碱基组成进行设置。克隆与测序PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后，利用OMEGA公司的胶回收试剂盒回收产物，连接到pMD18T载体，构建重组质粒。转化大肠杆菌感受态细胞，筛选重组子并用菌落PCR检测，送由上海英俊生物技术服务有限公司测序。核苷酸序列分析采用I