檀香萜烯合成酶基因的克隆与序列分析.docx

檀香萜烯合成酶基因的克隆与序列分析【摘要】目的通过克隆技术获得参与檀香挥发油形成的萜烯合成酶基因。方法利用CTABLiCl法提取檀香已结香心材总RNA，采用RTPCR技术克隆萜烯合成酶基因。结果克隆获得了一个檀香萜烯合成酶基因，该基因编码区全长1731bp，编码576个氨基酸残基。结论CTABLiCl法能提取较高质量的檀香心材总RNA，克隆获得的萜烯合成酶具有编码区。【关键词】檀香;萜烯合成酶;基因克隆;序列分析Abstract:ObjectiveToclonetheterpenesynthasegenefromSantalumalbumL.whichparticipatesinthesynthesisofessentialoil.MethodsCTABLiCltreatmentwasusedtoextracttotalRNAfromtheheartwoodofSantalumalbumRTPCRwasemployedtoclonetheterpenesynthasegeneatthesameOneterpenesynthasegeneconsistedof1731bpnuclcacidwasclonedfromSantalumalbumL.,whichencodes576aminoacidresidues.ConclusionCTABLiCltreatmentcouldextracthighqualityRNAfromtheheartwoodofSantalumalbumL.,andtheclonedterpenesynthasegenehadtheopenreadingframe.Keywords:SantalumalbumL.;terpenesynthase;genecloning;sequenceanalysis名贵中药檀香为檀香科植物檀香(SantalumalbumL.)的树干心材，为行气温中、开胃止痛之常用中药。檀香原产于印度、印度尼西亚等地，1962年华南植物园从印尼引种檀香并在广东地区试种成功。檀香在自然生长情况下需10年左右才能初步形成具有芳香气味的心材(俗称结香)，30年以上才能供药用，檀香心材挥发油是其主要活性成分，已有研究表明檀香挥发油主要成分为萜烯类化合物，其中檀香醇等倍半萜烯类占挥发油总量的60%～80%。目前国内外对檀香研究的报道主要集中于檀香栽培技术和檀香挥发油组分分析上，而对檀香心材挥发油积累机理却鲜见报道。鉴于此，本研究拟对参与檀香萜烯类化合物生物合成过程中的关键酶——萜烯合成酶基因进行克隆和分析。萜类物质的前体异戊烯基焦磷酸在萜烯合成酶的作用下形成不同的萜类骨架，经过不同修饰酶的作用后形成不同的萜类化合物，该酶基因的克隆将为阐明檀香挥发油积累的机理提供理论支持，同时也为利用基因工程手段培育檀香良种、缩短檀香生长年限以及提高檀香挥发油含量等方面研究奠定坚实的基础。1材料与方法材料和试剂材料供试材料为广东湛江南药试验场的已结香檀香(SantalumalbumL.)心材，檀香树由广东省中药研究所邱金裕研究员鉴定为檀香科植物檀香SantalumalbumL.。采用钻孔取样的方式收集已结香部分心材，装入试管后迅速放入液氮罐速冻，取回后保存于-80℃冰箱。试剂RNA提取试剂包括溶液Ⅰ与溶液Ⅱ，溶液Ⅰ:2%CTAB,2%PVPK30,2mol·L-1NaCl，100mmol·L-1TrisHCl()，25mmol·L-1EDTA()，g·L-1亚精胺。溶液Ⅱ:%SDS，1mol·L-1NaCl，10mmol·L-1TrisHCl()，1mmol·L-1EDTA()，2种试剂均用DEPC水配制。反转录试剂盒：采用Takara公司的PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit。克隆试剂盒：采用北京天根生化科技有限公司的pGMT试剂盒。TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAMarker、T4DNALigase、限制性内切酶等均为Takara产品;引物合成和测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。其他试剂为国产分析纯。方法檀香心材RNA提取参照Chang等方法进行提取并稍加改良。改良之处为用三氯甲烷/异戊醇(24∶1)抽提两次、用10mol·L-1LiCl沉淀过夜，其他不变。反转录采用Takara公司PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit反转录RNA成cDNA。步骤为：(1)在离心管中依次加入总RNA4μL，oligo(DT)1μL，dNTP(10mmol·L-1)1μL，加RNasefreewater至总体积10μL;(2)65℃保持5min，迅速取出冰上放置3min;(3)按顺序分别加入5×Buffer4μL，RNase