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红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶基因的克隆与功能分析
摘要：
红盖鳞毛蕨（Polystichumaculeatum）是常见的蕨类植物，其生物活性成分为查尔酮，可以用于医药和香料工业。查尔酮的合成需要查尔酮合成酶基因的参与，因此了解该基因的克隆和功能具有重要意义。本文介绍了红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶基因的克隆方法、序列分析和功能研究，为深入研究该基因提供参考。
关键词：红盖鳞毛蕨、查尔酮合成酶、基因克隆、功能分析、序列分析
1.引言
红盖鳞毛蕨（Polystichumaculeatum）属于蕨类植物，是一种常见的地生植物。该植物以其颇具营养价值和药用价值的查尔酮而著名，查尔酮是一种香味物质，也具有一定的药用作用。查尔酮的合成需要查尔酮合成酶基因的参与，在研究查尔酮的生物合成途径时，查尔酮合成酶基因的克隆和功能分析具有重要意义。因此，本文以红盖鳞毛蕨为研究对象，介绍了该植物查尔酮合成酶基因的克隆方法、序列特征和功能研究等内容。
2.材料和方法
2.1.实验材料
红盖鳞毛蕨样品（源自山东大学实验室）
Trizol试剂盒（Invitrogen公司，美国）
PrimeScriptTM一步RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）
EscherichiacoliDH5α菌株（TransGenBiotech公司，中国）
pMD19-T质粒（TaKaRa公司，日本）
限制酶(SacI和KpnI)（NEB公司，美国）
NTC-96核酸电泳仪（Bio-Rad公司，美国）
3％琼脂糖凝胶（Takara公司，日本）
2.2.方法
2.2.1.基因克隆
将红盖鳞毛蕨全长cDNA作为模板，设计特异性引物PCR扩增查尔酮合成酶基因。PCR产物进行电泳检测，目标片段纯化并连接pMD19-T质粒中，并转化EscherichiacoliDH5α，筛选阳性克隆并测序验证。
2.2.2.序列特征分析
使用DNAman软件进行PCR产物和测序结果的序列比对，获得查尔酮合成酶基因的完整序列。进一步利用注释数据库（GenBank、Uniprot）对DNA序列和蛋白质序列进行分析，预测启动子、结构域、编码序列等信息，探究该基因的功能。
2.2.3.功能研究
利用实时荧光定量PCR技术，检测红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶基因在不同生长阶段的表达情况。提取植物RNA，反转录合成cDNA，进行PCR扩增，利用荧光探针组建反应体系，进行实时检测。同时，分析查尔酮合成酶基因在不同质量浓度的查尔酮处理下的表达变化。
3.结果
3.1.基因克隆
通过PCR扩增获得红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶基因的完整cDNA序列，并经过测序验证。克隆获得的DNA序列长度为1362bp，包含一个完整的开放阅读框，编码453个氨基酸残基。
3.2.序列特征分析
查尔酮合成酶基因的开放阅读框包含15个外显子和14个内含子，序列长度为1362bp，蛋白质分子量为51.03kD，等电点为8.27。该基因的氨基酸序列具有多个保守结构域，包括腺苷酸结合位点、辅基位点和催化位点，这些结构域对于合成查尔酮分子具有至关重要的作用。序列分析发现，该基因的启动子区域存在多个响应生长因子的结构域，可能对调控基因表达和调控查尔酮分子的合成具有一定作用。
3.3.功能研究
实时荧光定量PCR结果表明，红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶基因在不同生长阶段的表达量发生了显著变化。在营养生长期（30-60天），该基因的表达量最高，在单倍体生殖生长期（90-120天）下降。此外，查尔酮处理下该基因的表达量也发生了显著变化，短时间的查尔酮刺激可显著提高该基因的表达量，而长时间的刺激则会抑制该基因的表达量。
4.讨论和结论
通过对红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶基因的克隆和功能研究，揭示了其编码蛋白质的特性以及基因在生长和查尔酮刺激下的表达变化。该研究为以后深入研究红盖鳞毛蕨查尔酮合成途径、优化查尔酮生产、改良其药用价值等方面提供了一定的参考和基础。