氟西汀对海马神经元生长的影响.docx

氟西汀对海马神经元生长的影响【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠氟西汀是5-羟色胺再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。1材料与方法1新生大鼠海马神经元的分离和培养技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠，无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank‘s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量%的胰酶，37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F125ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基，以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。2大鼠海马神经元的鉴定烯醇化酶免疫细胞化学染色取培养6d6孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的NSE免疫组织化学染色。弃去培养液，4%多聚甲醛室温固定1h，加入%H2O2甲醇去除内源性过氧化氢酶，%TritonX-100破膜，10%绵羊血清封闭，加入一抗1∶200兔抗鼠NSE抗体，4℃湿盒过夜，mmol·L-1PBS清洗，加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG，放入37℃温箱孵育60min;mmol·L-1PBS清洗，滴加SABC过氧化物酶复合物，37℃温箱中孵育60min，mmol·L-1PBS清洗，滴加DAB显色液作用3～10min，自来水冲洗后，常规脱水，透明封片。光镜下观察NSE表达阳性细胞。尼氏染色6孔培养板的细胞培养7d时，取出盖玻片进行尼氏染色。弃去培养液，mmol·L-1PBS清洗，4%多聚甲醛室温固定1h，mmol·L-1PBS清洗3次，氯仿中1min，95%、70%乙醇各1min，蒸馏水清洗，置于1%甲苯胺蓝染液中染色20min，95%乙醇分化，在显微镜下观察控制，时间以尼氏体显示清晰为准，37℃干燥，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。实验分组在培养的第3天加入氟西汀，根据药物浓度不同，将实验细胞分为5组，分别加入1、10、20、40μmol·L-1氟西汀;正常对照组加入等体积的培养基。4海马细胞形态定量分析倒置相差显微镜下观察加药48h后的海马神经元形态，每组各孔随机选择20个视野，记录每个视野内细胞长出突起的神经元数目，目镜测微尺随机测量15个神经元突起的长度和胞体的长径。5统计学处理应用软件进行统计分析，各项检测结果以x-±s表示。多组比较及组间两两比较采用方差分析。2结果海马神经元形态学观察倒置相差显微镜下观察，培养1d，细胞绝大部分贴壁，细胞形态大小不一，以单突起的小细胞为主。培养6d，神经元胞体较大，突起进一步增多、延长，并形成稀疏的网络。培养12d，神经元胞体进一步增大，突起形成比较稠密的网络。培养24d，神经元胞体出现空泡，部分神经元死亡，胞体崩解，突触断裂。海马神经元鉴定NSE免疫细胞化学染色:染色后光镜下观察第6天的神经细胞，胞浆和突起被染成棕黄色为NSE抗体表达阳性细胞，以3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，经鉴定神经元的纯度为90%。见图2A。氟西汀对海马神经元形态学的影响结果见表1和图3。不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的，10μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长;40μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目减少，最长突起长度及胞体长径无显着性差异;1、20μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无显着性差异。表1氟西汀对加药48h海马神经元形态学的影响3讨论本实验严格控制胰酶的量和消化时间，采用了%胰蛋白酶低浓度溶液、30min长时间消化的方法，尽可能减少分离过程中的化学损伤。为了避免操作过程中的机械损伤，分离时动作轻柔，规律换药，每72h半量换液1次，换液时速度快，以减少对神经元生长的影响。本实验采用了差速贴壁生长，去除了成纤维细胞，并采用B27无血清培养基，可以选择性地促使神经元生长，抑制非神经元的生长和繁殖［3］，从而可以纯化海马神经