大豆β-伴大豆球蛋白基因RNAi表达调控机理研究.doc

大豆β-伴大豆球蛋白基因RNAi表达调控机理研究β-伴大豆球蛋白是大豆蛋白中的主要抗原蛋白,它能引起人和畜禽产生过敏反应,限制了大豆及其产品的广泛应用。因而,有必要降低和消除大豆中β-伴大豆球蛋白的含量,提高其营养价值。目前常用的消除方法有物理方法、化学方法、生物方法等,但这些消除方法效果都不够理想。利用育种方法选育致敏蛋白缺失型大豆是解决大豆抗原蛋白致敏性的最有效方法。传统育种方法受育种周期、种质资源等条件的限制,育成的β-伴大豆球蛋白缺失材料十分有限。近年来迅猛发展起来的RNAi技术为大豆的品质性状改良提供了一条新途径。目前利用RNAi技术对单一基因表达调控的研究较多并已取得成功,但对多基因干扰后表达调控效果的研究尚无报道。β-伴大豆球蛋白主要由α′亚基、α亚基、β亚基三个亚基组成。因此根据RNAi的原理,抑制各亚基基因mRNA的表达量,就能够有效降低β-伴大豆球蛋白在大豆中的含量,从根本上消除其过敏性,进而提高其营养价值。本研究利用RNAi技术分别调控β-伴大豆球蛋白的α′亚基基因、α亚基基因、β亚基基因及α′亚基和β亚基双价基因的表达,利用PCR、实时荧光定量PCR、β-伴大豆球蛋白酶联免疫技术,结合品质分析技术和农艺性状的鉴定,研究和评价RNAi技术对β-伴大豆球蛋白的三个主要亚基基因的表达调控机理和效率,探讨对多个目标基因协同表达调控的新途径,并创制大豆新种质资源。得到下列主要研究结果:1.成功克隆了ihpRNA的两个功能片断,构建了以BADH基因为筛选标记的安全型β-伴大豆球蛋白α亚基基因RNAi表达载体。将该表达载体转化吉农27大豆,经PCR检测,获得了11株T0代阳性植株,4株T1代阳性植株,6株T₂代阳性植株;T₂代转化植株经Southern杂交检测有3株出现杂交信号,表明α亚基基因RNAi表达载体已经以1-2个拷贝形式整合到大豆基因组中;对这3株植株进行实时荧光定量PCR检测,结果表明α亚基基因mRNA表达量明显被抑制,其干扰效率分别为82.3%、85.1%、70.6%;酶联免疫法检测其籽粒中β-伴大豆球蛋白含量,结果表明该蛋白降低了46.42%⁶3.07%。2.将实验室保存的β-伴大豆球蛋白β亚基基因RNAi表达载体转化吉农27大豆,经PCR检测获得了10株T0代阳性植株,13株T1代阳性植株,6株T₂代阳性植株;T₂代阳性植株Southern杂交显示有2株出现杂交信号,均为单拷贝,表明β-伴大豆球蛋白β亚基基因RNAi表达载体已经以单拷贝形式整合到大豆基因组中;对这2株转基因植株实时荧光定量PCR检测,结果表明β亚基基因的mRNA表达量均明显受到抑制,干扰效率分别为77.5%和82.8%;酶联免疫法检测其籽粒中β-伴大豆球蛋白含量,结果表明该蛋白降低了48.11%⁵8.73%。3.对实验室保存的转β-伴大豆球蛋白α′亚基RNAi表达载体的T1代PCR阳性大豆种子扩繁,将获得的6株T₂代阳性植株按株行种植,PCR检测结果表明T3、T₄代均有阳性植株检出;T₄阳性植株Southern杂交检测显示有5株出现杂交信号,表明β-伴大豆球蛋白α′亚基基因RNAi表达载体已经以1-2个拷贝形式整合到大豆基因组中;对这5株T₄转基因植株实时荧光定量PCR检测表明α′亚基基因mRNA表达量明显受抑制,干扰效率为43.56%⁸8.6%;酶联免疫法检测其籽粒中β-伴大豆球蛋白含量,结果表明该蛋白降低了22.67%⁶9.57%。4.成功构建了β-伴大豆球蛋白α′亚基和β亚基基因双价RNAi表达载体。并将其转入吉农28大豆。经PCR检测获得了11株T0代阳性植株,11株T1代阳性植株,4株T₂代阳性植株;T₂代阳性大豆植株Southern杂交检测显示有3株出现杂交信号,表明构建的双价RNAi表达载体已经以1-2个拷贝形式整合进转基因大豆基因组;对这3株T₂代转基因大豆植株实时荧光定量PCR检测,结果表明α′亚基基因和β亚基基因mRNA表达量均受到明显抑制,其中β亚基基因干扰效率分别为76.80%、86.1%、78.4%,α′亚基基因干扰效率分别为63.2%、62.19%、74.6%;酶联免疫法检测其籽粒中β-伴大豆球蛋白含量,结果表明该蛋白含量降低了46.8%⁶6.09%。5.利用近红外谷物分析仪,对5株转β-伴大豆球蛋白α′亚基基因RNAi表达载体T₄转基因