大豆β-伴大豆球蛋白α’-亚基基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究.doc

大豆β-伴大豆球蛋白α’-亚基基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究大豆蛋白是人和动物的主要的植物蛋白来源,约占大豆种子的40%,其中含有90%的贮藏蛋白,7s蛋白和11s蛋白是大豆贮藏蛋白的主要成分,研究表明,调节二者比例可以改善大豆蛋白加工适应性,提高1ls蛋白含量降低7s蛋白的含量可以改善大豆蛋白的营养品质。7s蛋白中的主要成分为β-伴大豆球蛋白,它是大豆中引起婴儿和幼龄动物消化道过敏反应的主要大豆抗原蛋白。α’、α和β是β-伴大豆球蛋白的三个主要亚基,这三个亚基均被证明是潜在的食物致敏因子。p-伴大豆球蛋白拥有较好的热稳定性,通过常规的加热处理对其抗原活性的降低效果非常有限,因此,通过育种手段降低β-伴大豆球蛋白含量是目前降低其活性的主要途径。到目前为止,人们已经得到了一系列经自然变异或人工诱变产生的具有p-伴大豆球蛋白不同亚基缺失表现的育种材料,并对其分子基础进行了深入研究。但是,通过基因工程手段以达到降低β-伴大豆球蛋白各亚基含量的研究还鲜见报道。故本研究根据RNA干扰技术原理,克隆了β-伴大豆球蛋白α’-亚基基因的核心保守序列中一段400bp大小的片段,采用基因工程手段,分别构建了以抗除草剂Bar基因和耐盐碱BADH基因为筛选标记的a’-亚基基因ihp-RNAi高效表达载体p3301-PFNZ和p3301-PFNZ-BADH两个单价表达载体及以Bar基因为筛选标记的双价表达载体p3301-α’+β。通过农杆菌介导法和花粉管通道法将两个单价表达载体导入大豆,经过抗性筛选,并对转基因植株进行PCR检测,Southernblot杂交,]RT-PCR和ELISA检测,以期应用RNA干扰技术对β-伴大豆球蛋白α’-亚基基因的表达调控加以研究,为应用基因工程技术进行大豆品质改良奠定了基础。主要实验结果如下：分别克隆了构成ihp-RNAi表达载体结构的4个片段：种子特异性启动子7ap,α’-亚基基因正义和反义片段及功能性间隔序列intron-s。以植物表达载体pCAMBIA3301为基础,经双酶切连接的方法依次连入种子特异性启动子7αp、α’-亚基基因反义片段,功能性间隔序列intron-s和α’-亚基基因正义片段,构成以植物表达载体pCAMBIA3301本身带有的抗除草剂Bar基因为筛选标记的ihp-RNAi表达载体p3301-PFNZ。克隆耐盐碱基因BADH,利用XholⅠ单酶切替换了表达载体p3301-PFNZ中的抗除草剂基因Bar,并通过EcoRⅠ单酶切鉴定方向后,构建了以BADH基因为筛选标记的安全型植物表达载体p3301-PFNZ-BADH。将已克隆好的p-伴大豆球蛋白β-亚基基因的正义片段和反义片段分别插入到启动子7αp下游和终止子nos上游,并通过酶切鉴定其插入方向,构建成β-伴大豆球蛋白a’-亚基和β-亚基的双价ihp-RNAi表达载体p3301-α’+β。采用农杆菌介导法将两个单价表达载体导入受体大豆,经抗性筛选和PCR初步检测得到耐盐碱的T0代“吉农27”转基因大豆15株,抗草铵膦T0代“吉农28”转基因大豆10株,转化率为2.1%。采用花粉管通道法将两个单价表达载体导入受体大豆,共获得780粒转化籽粒,其中转p3301-PFNZ-BADH籽粒：“吉农27"125粒,“吉新豆1号”112粒,“通农13"143粒；转p3301-PFNZ籽粒：“吉农27"123粒,“吉新豆1号”131粒,“通农13"146粒。经抗性筛选并PCR检测,从获得的幼苗中初步筛选出耐盐碱阳性植株“吉农27"10株,“吉新豆1号”7株,“通农13"5株；抗草铵膦阳性植株：“吉农27"8株,“吉新豆1号”6株,“通农13"5株；平均转化率为3.2%。对转基因后代进行PCR检测,获得农杆菌介导法转化的T1代阳性植株45株,其中耐盐碱“吉农27”T1代阳性植株25株,抗草铵膦“吉农28”T1代阳性植株20株。为了进一步鉴定表达载体的T-DNA区是否整合到大豆基因组中,随机分别抽取吉农27和吉农28的T1代阳性植株提取基因组,以BADH/Bar为探针进行Southern杂交检测,结果阳性植株均出现杂交信号,非转基因植株没有出现杂交信号,由此证明两个单价表达载体的T-DNA区已整合到大豆基因组中。对经过Southern杂交分析为阳性的转基因植株进行RT-PCR检测,结果表明转基因植株的α’亚基基因(?)nRNA量明显低于非转基因植株,表明RNA干扰机制在转录后水平发挥了作用。选取经RT-RCR检测证明mRNA表达量降低的转基因大豆成熟籽粒进行ELISA检测,结果表明,转基因大豆中7S蛋白含量和免疫活性均有所下降,平均下降率在10%左右,说明RNA干扰在蛋白表达水平上也发挥了作用。