蛋白质免疫印迹技术专家讲座.pptx

试验二蛋白质免疫印迹技术一、免疫学免疫学研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，而且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。伴随免疫生物学发展，人们发觉在高等动物体内存在着含有免疫功效组织结构（即免疫系统）。免疫系统功效生理和病理表现当外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后，能够激活机体免疫系统，产生对外源物质排除作用，从而保护机体免受外源物质侵害。机体这一特异免疫应答功效细胞基础是淋巴细胞。抗原和免疫原性抗原分类抗体种类抗原抗体反应（antigen-antibodyreaction）是指抗原与对应抗体之间所发生特异性结合反应。可发生于体内（invivo），也可发生于体外（invitro）。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参加反应及中和反应等各种不一样反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体检测中多采取血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应（serologicreaction）。二、印迹法（blotting）三、蛋白免疫印迹应用蛋白质免疫印迹检测技术一、试验目标二、试验原理将适当抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体血清称为免疫血清。优质免疫血清产生，主要取决于抗原纯度和免疫原性，以及动物应答能力。另外，尚需考虑免疫路径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有没有佐剂等原因。（一）多克隆抗体概念抗体结构（二）用于免疫动物动物种类选择主要依据抗原生物学特征和所要取得抗血清数量。如要取得大量抗体，多采取大动物；如要是取得直接标识诊疗抗体，则直接采取本动物；如要取得间接标识诊疗用抗体，则必须用异源动物制备抗体；假如难以取得抗原，且抗体需要量少，则能够采取纯系小鼠制备。普通试验室采取抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量血清。（三）抗原（四）免疫路径皮下注射（五）佐剂佐剂主要可分为两种：一个本身含有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一个本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。当前实践中常应用佐剂福氏佐剂。（六）免疫方法抗体产生次序与丰度（七）抗血清采集与保留（八）抗血清质量评价效价抗血清效价，就是指血清中所含抗体浓度或含量。效价测定方法惯用是单向扩散免疫法，此法对全部抗体均适用。一些由大分子（如蛋白类）抗原所产生抗体，可用双扩散等方法测定。单向扩射免疫法：以不一样稀释度抗血清与优质标识抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%血清稀度和为效价。如某抗血清结合率为50%时稀释度为1：15000,则该血清效价就是1：15000制备含有一定浓度抗血清琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，加入不一样稀释度抗原量，进行免疫扩散。抗原与对应抗体在浓度适当时，则形成清楚沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考抗原形成沉淀环绘成曲线，然后以待测标本沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原含量。双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，二者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。分子杂交原理及流程图WesternBlot原理免疫印迹试验包含五个步骤：⑴固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。⑵封闭：保持膜上没有抗体结合场所，使场所处于饱和状态，用以防止特殊性抗体单独结合到膜上。三、试验仪器动物常规免疫四、操作步骤抗原提取与制备1）0.5mg/mL菠萝蛋白酶以0.9%生理盐水溶解配置（加少许NaOH促溶）（周二上、周五上）。2）纯化鸡卵类粘蛋白（周四早晨）。3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理盐水溶解配置（加少许NaOH促溶）（周四下午）。苦味酸（以75%乙醇配置）标识小鼠初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠（1）抗原与佐剂混合：取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水形态（2）用酒精棉球消毒待注射部位（3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原反应，两周后进行加强免疫加强免疫：初级免疫后两周进行。取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水形态。加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠（1）用酒精棉球消毒待注射部位（2）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。第二次加强免疫后一周，即可采血，搜集抗血清。小鼠取血。搜集血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，析出血清，离心，3000rpm,10min。吸出血清，分装（0.05～0.2mL），贮于-20℃以下冰箱保留。WesternBlot普通流程转移电