蛋白质免疫印迹技术.ppt

蛋白质免疫印迹技术一、免疫学免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。

随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系统）。免疫系统功能的生理和病理表现当外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统，产生对外源物质的排除作用，从而保护机体免受外源物质的侵害。
机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋巴细胞。抗原和免疫原性抗原的分类抗体的种类抗原抗体反应（antigen-antibodyreaction）

是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（invivo），也可发生于体外（invitro）。
体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；
体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。
因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应（serologicreaction）。二、印迹法（blotting）三、蛋白免疫印迹的应用蛋白质免疫印迹检测技术一、实验目的二、实验原理将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为免疫血清。
优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素。（一）多克隆抗体的概念抗体的结构（二）用于免疫的动物动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。
如要获得大量的抗体，多采用大动物；
如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；
如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；
如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备。
一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。
（三）抗原（四）免疫途径皮下注射（五）佐剂佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。

目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。（六）免疫方法抗体的产生顺序与丰度（七）抗血清的采集与保存（八）抗血清质量的评价效价抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体均适用。
某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。
单向扩射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。
如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000,则该血清的效价就是1：15000
制备含有一定浓度抗血清的琼脂凝胶板（抗体固定不变）。打孔，加入不同稀释度的抗原量，进行免疫扩散。抗原与相应抗体在浓度合适时，则形成清晰的沉淀环，其直径大小与所加抗原量成正比。将已知参考抗原形成的沉淀环绘成曲线，然后以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，计算出待测抗原的含量。
双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。分子杂交原理及流程图WesternBlot原理免疫印迹的实验包括五个步骤：

⑴固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。
⑵封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。三、实验仪器动物的常规免疫四、操作步骤抗原的提取与制备
1）0.5mg/mL菠萝蛋白酶以0.9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五上）。
2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。
3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理盐水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周四下午）。
苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠
（1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态
（2）用酒精棉球消毒待注射部位
（3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL
初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进行加强免疫

加强免疫：初级免疫后两周进行。
取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。
加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠
（1）用酒精棉球消毒待注射部位
（2）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。

第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。
第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。
小鼠