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三种荧光定量PCR检测方法比较定量pcr：以参考物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达成评定样本中靶基因拷贝数，称为定量PCR。定量PCR可行性定量通常是在PCR扩增指数期进行。常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：(1)SYBRGreenI检测模式SYBRGreenI是一个能和双链DNA结合发光荧光染料。其和双链DNA结合后，荧光大大增强。所以，SYBRGreenI荧光信号强度和双链DNA数量相关，能够依据荧光信号检测出PCR体系存在双链DNA数量。SYBRGreenI最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。PCR扩增程序通常为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。SYBRGreenI缺点：因为SYBRGreenI没有特异性，不能识别特定双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。SYBRGreenI优点：SYBRGreenI优点是因为其缺点产生，因为它能全部双链DNA相结合，所以对不一样模板不需尤其定制不一样特异性探针，通用性很好，而且价格相对较低。这对科研是很有利，所以中国外在科研中使用比较普遍。(2)水解探针模式(taqman探针)TaqMan探针是一个寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当探针和靶序列配对时，荧光基团发射荧光因和3’端淬灭剂靠近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团和淬灭剂分离，发射荧光。一分子产物生成就伴伴随一分子荧光信号产生。伴随扩增循环数增加，释放出来荧光基团不停积累。所以Taqman探针检测是积累荧光。PCR扩增程序通常是：94℃～60℃40个循环。常见荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。(3)杂交探针模式(Beacon、FRET)分子信标是一个呈发夹结构茎环双标识寡核苷酸探针，两端核酸序列互补配对，所以标识在一端荧光基团和标识在另一端淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标茎环结构中，环通常为15-30个核苷酸长，并和目标序列互补;茎通常5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎结构。荧光基团标识在探针一端，而淬灭剂则标识在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配正确茎环双链解开，假如有模板存在环序列将和模板配对。和模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团和淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。因为是酶切作用存在，分子信标也是积累荧光。常见荧光基团：FAM，TexasRed。PCR扩增程序通常是：94～55～72℃三步法，40个循环。FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针5`端标识FAM荧光基团，另一探针3`端标识Red640荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM基团和Red640基团相邻，激发FAM产生荧光，作为Red640基团激发光被吸收，使Red640发出波长为640荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640波长荧光。因为FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非累积信号。常见荧光基团是：LC-Red640，LC-Red705。能用于实时荧光PCR定量方法很多，各有优缺点，应依据试验需要和目前试验条件选择适合自己方法。下面为多种方法比较：试验中部分好习惯：加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完以后要归到最大计量位置，预防久而久之弹簧失去弹性。一定要记着关水浴箱，切记切记;多和大家讨论，同时多关注她人讨论经验，这几乎是最快提升捷径了;全部试剂全部自己配，出了问题才好找原因。预防RNA酶污染方法：1.全部玻璃器皿均应在使用前于180℃高温下干烤6h或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用)。3.有机玻璃电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4.配制溶液应尽可能用0.1%DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留DEPC。不能高压灭菌试剂，应该用DEPC处理过无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，试验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用试验室，全部器械等应为专用。常见RNA酶抑制剂：1.焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一个强烈但不根本RNA酶抑制剂。它经过和RNA酶活性基团组氨酸咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶活性。2.异硫氰酸胍：现在被认为是最有效RNA酶抑制剂，