一种荧光定量PCR反应液及荧光定量PCR方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102465120A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102465120A(43)申请公布日2012.05.23(21)申请号201010538264.4(22)申请日2010.11.10(71)申请人深圳华大基因科技有限公司地址518083广东省深圳市盐田区北山工业区综合楼申请人深圳华大基因研究院(72)发明人张庆辉陈敏峰黄业博陈城超孙勇张秀清杨焕明(74)专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人程泳(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书88页页序列表序列表11页页附图附图33页页(54)发明名称一种荧光定量PCR反应液及荧光定量PCR方法(57)摘要本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及一种荧光定量PCR反应液，其特征在于包含PCR反应增强剂，所述PCR反应增强剂选自二甲亚砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵和甜菜碱中的一种或多种，例如二甲亚砜、牛血清白蛋白和甜菜碱。本发明的荧光定量PCR反应液还包含具有5′-3′聚合酶活性和5′-3′外切酶活性的耐热DNA聚合酶，优选为同时具有3′-5′外切酶活性的耐热DNA聚合酶和热启动耐热DNA聚合酶。本发明还涉及包含所述反应液的试剂盒以及利用所述反应液进行荧光定量PCR的方法。CN102465ACN102465120A权利要求书1/1页1.一种荧光定量PCR反应液，其特征在于所述反应液中包含二甲亚砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、聚乙二醇6000、亚精胺、硫酸铵和甜菜碱中的一种或多种。2.权利要求1的反应液，其特征在于所述反应液中包含二甲亚砜、牛血清白蛋白和甜菜碱。3.权利要求1的反应液，其还包含耐热DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5′-3′聚合酶活性和5′-3′外切酶活性，优选地，所述DNA聚合酶具有3′-5′外切酶活性，更优选为ExTaqTMDNA聚合酶。4.权利要求3的反应液，其中所述DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，优选为ExTaqTM热启动DNA聚合酶。5.一种荧光定量PCR反应液，其特征在于反应液的成份包含10-67mMpH8.2-9.0Tris-HCl、25-50mMKCl、1.5-5.0mMMg2+、0.2-0.4mMdNTP、0.05％-0.1％Tween20、1％-10％二甲亚砜、0.1μg/μl-1μg/μl牛血清白蛋白、0.5-2M甜菜碱和0.04-0.2U/μl热启动DNA聚合酶。6.权利要求5的反应液，其中所述的Mg2+为2.5-3mM，二甲亚砜为1.2％-5％，牛血清白蛋白为0.1-0.8μg/μl，甜菜碱为1-1.2M，热启动DNA聚合酶为0.05-0.07U/μl。7.一种荧光定量PCR试剂盒，其包含权利要求1-6任一项所述的反应液。8.一种荧光定量PCR方法，其特征在于所述方法包含使用权利要求1-6任一项所述的反应液的步骤。2CN102465120A说明书1/8页一种荧光定量PCR反应液及荧光定量PCR方法技术领域[0001]本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及一种荧光定量PCR反应液及荧光定量PCR方法，特别是用于长核苷酸片段的定量PCR反应液和方法。背景技术[0002]荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR，也称为定量PCR，简称为QPCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。[0003]荧光定量PCR根据化学原理的不同可分为探针法和染料法。其中Taqman荧光定量技术以Taqman荧光探针为基础。Taqman荧光探针，也称为水解探针，为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测系统就可以接收到荧光信号。具体地，当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭；在进行延伸反应时，Taq聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生，随着扩增产物的增加，荧光增强(Heid，C.A.，J.Stevens，K.J.Livak，etal.RealtimequantitativePCR[J].GenomeRes，1996，6：986-994.)。[0004]Taqman水解探针由于其特异性较高而广范地应用于荧光定量PCR实验。一般情况下，为了保证理想的扩增效率(90％～110％)，要求荧光定量PCR