多重荧光定量PCR的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106868140A(43)申请公布日2017.06.20(21)申请号201710121610.0(22)申请日2017.03.02(71)申请人北京酷搏科技有限公司地址100871北京市海淀区中关村北大街127号1层103-30室(72)发明人虞之龙刘玚邱海维(74)专利代理机构北京康信知识产权代理有限责任公司11240代理人赵囡囡吴贵明(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书2页说明书15页序列表2页附图10页(54)发明名称多重荧光定量PCR的方法(57)摘要本发明提供了一种多重荧光定量PCR的方法。该方法包括：将多个目标片段的扩增引物对置于同一扩增体系中进行PCR扩增，PCR扩增包括N轮热循环，10≤N≤50；每轮热循环后对PCR产物进行程序升温，获得多个目标PCR扩增片段形成的混合片段的熔解曲线；计算每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量，进而建立各单一目标片段的含量随PCR热循环次数增加而变化的扩增曲线；根据扩增曲线计算得到各单一目标片段对应的Ct值，进而根据Ct值计算得到各单一目标片段的起始浓度。该方法能利用单个光学采集通道的数据实现对各目标扩增片段进行准确检测和定量，且不受目标片段数量、多个目标片段的解链温度是否已知或是否接近的限制。CN106868140ACN106868140A权利要求书1/2页1.一种多重荧光定量PCR的方法，其特征在于，所述方法包括：将多个目标片段的扩增引物对置于同一扩增体系中进行PCR扩增，所述PCR扩增包括N轮PCR热循环，10≤N≤50；每一轮PCR热循环后，对PCR产物进行程序升温，获得所述多个目标片段形成的混合片段的熔解曲线；根据所述混合片段的熔解曲线，计算所述每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量，进而建立各单一目标片段的含量随PCR热循环次数增加而变化的扩增曲线；根据各单一目标片段的扩增曲线计算得到各单一目标片段对应的Ct值，进而根据所述Ct值计算得到各单一目标片段的起始浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过对所述混合片段的熔解曲线进行拟合的方式，计算所述每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过利用公式(2)对所述混合片段的熔解曲线进行拟合的方式，计算所述每一轮PCR热循环后各单一目标片段的含量：在所述公式(2)中，x表示温度，y表示观测到的相对荧光强度，n表示目标片段的数量，n为≥2的整数，i为自然数，参数ai表示第i个的目标片段的含量所对应的荧光强度，参数bi表示第i个目标片段的荧光强度随温度线性变化的系数，参数ci表征第i个目标片段在温度为Tmi±5℃范围内荧光强度的下降速率，参数d表示背景荧光强度，参数Tmi表示第i个目标片段的熔解温度，e为自然常数。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，获得所述公式(2)的步骤包括：建立各单一目标片段的熔解曲线；利用公式(1)对各所述单一目标片段的熔解曲线进行拟合；将各所述单一目标产物的熔解曲线的拟合公式进行叠加，得到所述公式(2)；在所述公式(1)中，x表示温度，y表示观测到的相对荧光强度，参数a表示对应的单一目标片段的含量所对应的荧光强度，参数b表示对应的单一目标片段产物的荧光强度随温度线性变化的系数，参数c表征对应的单一目标片段在温度为Tm±5℃范围内荧光强度的下降速率，参数d表示背景荧光强度，参数Tm表示对应的单一目标片段的熔解温度，e为自然常数。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述程序升温是按照0.5～10℃/s的升温速率从起点温度升至终点温度。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述起点温度为40～90℃，所述终点温度为60～100℃。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述每一轮PCR热循环后，在对所述PCR产物进行程序升温的过程中，对所述PCR产物的荧光强度进行采集，从而获得所述混合片段的熔解曲线。2CN106868140A权利要求书2/2页8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述采集的速率为0.2～100点/秒。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将多个目标片段的扩增引物对置于同一扩增体系中进行PCR扩增的步骤中，所述同一扩增体系中包括双链DNA染料。10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，建立各单一目标片段的熔解曲线的步骤包括：利用各单一目标片段对应的单一引物对进行PCR扩增，所述PCR扩增包括N轮PCR热循环，10≤N≤50，其中，每一轮PCR热循环的步骤包括：85～100℃的解链以及解链之后的40～75℃的延伸；在任意一轮PCR热循环后，优选在最后一轮PCR热循环后，采集各单一目标片段的PCR产物