蛋白各组分含量测定方法.doc

籽粒蛋白含量实验计划一、实验材料：w6nk2，浙农8号成熟籽粒二、分析测定指标：成熟籽粒在80度烘箱中烘干至恒重，用样品粉碎机(DFT50高速中药粉碎机)粉碎，过0.5mm筛。依据Liu等(2005)提出的方法利用0.5g样品顺序提取蛋白质组分：清蛋白，0.5g样品加10ml10mMTris-HCI(pH7.5)室温下置于连续振荡器上提取两次，每次2h，为提取残留物离心(4000g)10分钟，两次提取的上清液合并保存。依据同样步骤，球蛋白，加10ml1MNaCl，Tris-HCI在室温下提取两次，每次2h；醇溶蛋白，加15ml55％正丙醇(v/v)，Iris-HCl室温下提取两次，每次2h；谷蛋白，残留物加25ml0.24％五水合硫酸铜，1.68％KOH，0.5％酒石酸钾钠和50％(v/v)异丙醇提取显色液，室温震荡1.5h，再在60度恒温水浴震荡5min，离心(4000g)10min，550nm比色测定。2、蛋白质总量、蛋白组分含量的测定大麦籽粒蛋白质总量用近红外光谱分析仪(NIRA，Matrix.1，BrukerCo.，德国)测定，用本实验室早期建立的相关曲线计算(Yin等，2002)。清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量利用考马斯亮蓝法以牛白蛋白做标准曲线测定(Bradford，1976)，谷蛋白用Biuret法测定(Holme和Peck，1998)。或者蛋白质总量采用下面方法测定：在装有50mg面粉放入2ml离心管中，加入150µl提取液（10gKH2PO4，13gK2HPO4·3H2O，385mgDTT，加水至500ml），拧紧离心管盖子，室温下剧烈震荡1h。将匀浆1000g离心8min后，取上清用来测定蛋白质含量并跑电泳检测。蛋白质含量用Bradford(1976)方法测定，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白。