蛋白质含量测定方法比较.doc

蛋白质含量测定主要有五种方法分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点优缺点明确。凯氏定氮法蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化使蛋白质分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵留在消化液中然后加碱蒸馏使氨游离用硼酸吸收后再用盐酸标准溶液滴定根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外还含有其它含氮物质所以此蛋白质称为粗蛋白。优点：重现性好是目前分析有机化合物含氮量常用的方法是一种蛋白质测定的经典方法测试结果准确。缺点：操作比较繁复费时试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸生物碱含氮类脂卟啉含氮色素等非蛋白质含氮化合物。双缩脲定氮法双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中双缩脲与CuSO4形成紫色络合物称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键或能过一个中间碳原子相连的肽键这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。优点：较快速不同的蛋白质产生颜色的深浅相近以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质测定。缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。紫外吸收定氮法双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时形成紫色的络合物这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm波长下测定吸光度以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ml)作图得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好精密度好;呈色稳定性好试剂单一方法简便。快速不消耗样品测定后仍能回收使用。缺点：准确度较差干扰物质多在用标准曲线法测定蛋白质含量时对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的虽然经过校正测定的结果还是存在一定的误差。此外进行紫外吸收法测定时由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化因此要注意溶液的pH值测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。酚试剂法此法的显色原理与双缩脲方法是相同的只是加入了第二种试剂即Folin—酚试剂以增加显色量从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下蓝色深度与蛋白的量成正比。优点：灵敏度高比双缩脲法灵敏约100倍。操作简单不需要特殊仪器设备。缺点：费时间较长要精确控制操作时间标准曲线也不是严格的直线形式且专一性较差干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%）硫酸纳（1%）硝酸纳（1%）三氯乙酸（0.5%）乙醇（5%）乙醚（5%）丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响但这些物质浓度高时必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高显色后会色浅则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。进行测定时加Folin—酚试剂时要特别小心因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定但上述还原反应只在pH=10的情况下发生故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时必须立即混匀以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前还原反应即能发生。考马斯亮蓝法考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合使染料的最大吸收峰的位置（max）由465nm变为595nm溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残