电转酿酒酵母实验步骤.docx

电转酿酒酵母实验步骤（以含有单杂载体pAbAi整合后的Y1H菌株为例）1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于100mlSD/-Ura培养基中，30℃过夜培养至OD600=1.3，时间大概23h;3）酵母菌液置于冰上10min，然后于4℃4000g(1500r/min)离心收获培养细胞，将两管细胞置于一管，加入50ml冰冷的灭菌水重悬洗涤，重复两次。6）在离心后的酵母细胞中加入10ml冰冷的1mol/L山梨醇，离心。然后加入0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇重悬。7）电转化：在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul酵母菌细胞和小于等于100ng待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。转移至冰冷的电转槽中，置于冰上5min，然后进行电击，1.5KV档，电击时间在5.0-5.4ms。8）立即往电击槽中加入500ul冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀，吸入收集管中。在收集管中加入适量液体筛选培养基，30℃摇床150RPM孵育1-2h。9）直接涂布在选择培养基平板上，于30℃培养3-6天，直到平板上出现菌落。注意：转AD的菌液分别涂于有抗生素和无抗生素的两个板子上，用以判断是否转化成功。计算滴度涂于无抗生素板子上，参考浓度10ul稀释至100ul或直接涂100ul。