酵母单杂交实验步骤总结.doc

1pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAir报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。用TEbuffer溶解寡核苷酸至终浓度100mol/L。将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50mol/L）。95C保温30s，去除二级结构。72C保温2min，37C保温2min，25C保温2min。注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。冰上放置。退火后的产物可贮存在-20C冰箱备用。酶切1LpAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5mol/L。在连接反应管中加入如下成分：pAbAi载体（50ng/L）1.0Lannealedoligonucleotide（0.5mol/L）1.0L10×T4DNAligasebuffer1.5LBSA（10mg/mL）0.5LNuclease-freeH2O10.5LT4DNAligase（400U/L）0.5L总体积15L注：如果有必要，可用1Lnuclease-freeH2O代替寡核苷酸作为阴性对照。将反应体系室温放置连接3h，转化Ecoli，采用常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（图）图3Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图用BstBI或者BbsI酶切2LpBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。按MatchmakerYeastTransformationSystem2的步骤用1l酶切后的质粒转化Y1HGold酵母。稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。3d后挑取5个单克隆，用MatchmakerInsertCheckPCRMix1进行PCR检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴性对照。在PCR管中加25lPCR-gradeH2O。用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头伸进PCR-gradeH2O中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反应的进行。如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。向每个管中加入25lMatchmakerInsertCheckPCRMix，混匀，离心。每个PCR管中现已含有如下反应物：MatchmakerInsertCheckPCRMix25lH2O/yeast25l总体积50l按下述程序进行PCR反应；95C1min98C10s55C30s30cycles68C2min取5lPCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。注：引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约1.4kb。图4PCR检测pBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是：阳性对照：1.4kb阴性对照：无条带诱饵菌株：1.35kb+insertsize分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura平板上划线培养。30C孵育3d后，将平板置于4C保存，即为新构建的Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]对照菌株。经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用1mL预冷培养基（100ml灭菌的YPDA与50ml灭菌的75%甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70C保存。3检测诱饵菌株AbAr基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同。例如：p53-AbAi对照的最低aureobasidinA抑制浓度为100ng/ml。注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbAr基因的表达情况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9%NaCl重悬细胞，调节A600到0.00