基因扩增技术CR.ppt

PolymeraseChainReaction聚合酶链反应（PCR）Polymerasechainreaction又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，在模板DNA，引物（模板两端的已知序列）和四种脱氧核苷酸存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。PCR技术是由Cetus公司和加利福利亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为KaryBmulis和HeneryA、Erlich。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，能检测每10万个细胞中仅含一个靶DNA分子的样品。因而发明人KaryB、mulis获1993年诺贝尔化学奖。PCR的种类PCR温度循环参数PCR扩增效率（理论）PCR扩增效率（实际）PCR反应体系组成模板核酸人工合成的寡核苷酸-引物引物设计原则：软件+经验一般PCR反应中引物的终浓度为0.1-1mol/L，在此范围内产物量基本相同。引物浓度低于0.1mol/L时，产物量降低；引物浓度过高会引导非特异产物扩增，还会增加引物二聚体的形成。合适的缓冲体系Mg2+三磷酸脱氧核苷（dNTPs）耐热DNA聚合酶试剂原液浓度工作浓度50l体系PCR缓冲液1015L上游引物50mol/L0.5mol/L0.5L下游引物50mol/L0.5mol/L0.5LdNTPs10mmol/L200mol/L4LMgCl225mmol/L1.5mmol/L1.5LTaq酶5U/L2.5U/100L体系0.25LDNA模板102-105拷贝ddH2O补足50LPCR产物的分析持家基因选择的原则常用持家基因表达的稳定性常用持家基因在基因组序列中存在假基因情况不同类型细胞中持家基因表达的稳定性不同类型组织中持家基因表达的稳定性在前列腺癌组织中一些持家基因表达的稳定性PCR产物的分析待测模板的相对含量=样品荧光强度/内参照模板的荧光强度RT-PCR实验的策略RT-PCR实验的策略RT-PCR实验的策略RT-PCR实验的策略7、对很难扩增的片段可考虑用下游引物反转录。8、对长片段的策略。PCR污染的对策PCR污染的对策污染的处理巢式PCR(nestedPCR)实时定量荧光PCRTaqMan探针荧光染料掺入法实时定量PCR的Ct值概念实时定量PCR检测前列腺基质细胞中GAPDH和TGFb1表达的荧光曲线图(SYBRGreenI掺入法)实时定量PCR检测前列腺基质细胞中GAPDH和TGFb1表达的熔解曲线图（单一峰表明产物是单一的，无非特异扩增）实时定量PCR检测前列腺基质细胞中TGFb1的表达实时定量PCR检测前列腺基质细胞中TGFb1表达的柱形图TaqMan探针检测PSA质粒（107拷贝至103拷贝）的荧光曲线图TaqMan探针检测PSA质粒的Ct值得出的标准曲线y=-0,23x+11,06;r2=0,993（y是模板的对数，x是Ct）实时PCR定量检测将LNCap细胞梯度掺入到4ml外周血中PSA的表达（TaqMan探针方法）根据回归方程和Ct值，计算的得到的PSA的拷贝数(之间相差没有10倍，可能是扩增效率的原因，因为扩增质粒的效率是最高的）谢谢！