2023年QC七大手法基因工程复习归纳重点资料.doc

基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，通过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2023:世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。4.基因工程的基本环节（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，通过酶切消化或PCR扩增等环节，分离出带有目的基因的DNA片断。（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（具有目的基因）。（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。第二章DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(重要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。限制性核酸内切酶的功能与类型重要特性I型II型III型功能限切/修饰限切限切/修饰蛋白结构异源三聚体单体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM辨认序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋转对称序列GAGCCCAGCAG切割位点距辨认序列1kb处辨认序列内距辨认序列下游24-26bp处其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。特点：1.辨认、并切割双链DNA分子中特异序列的DNA内切酶。2.辨认序列为4-6碱基对的回文对称结构（旋转对称结构）。3.单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性。4.切割产物末端：5’突出末端、3’突出末端、平头末端.6.最适温度：大多为37℃,适盐浓度：高盐、中盐、低盐。8.当反映条件不适合时，辨认和切割序列发生变化（星号反映）。星活性（staractivity）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与辨认序列相似的序列，这个改变的特殊性称星活性。引起星活性的因素：①高浓度甘油（>5%）、②酶过量（>100U/mg）、③低离子强度（<25mM）④高pH(>pH8.0)、⑤有机溶剂、⑥用其它二价阳离子代替Mg2+，如Mn2+，Cu2+，Co2+,Zn2+。II型限制性核酸内切酶的命名具体规则是：以生物体属名的第一个大写字母和种名的前两个小写字母构成酶的基本名称，假如酶存在于一种特殊的菌株中，则将株名的一个字母加在基本名称之后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还需用一个大写字母表达这些非染色体的遗传因子。酶名称的最后部分为罗马数字，表达在该生物体发现此酶的先后顺序。例子：Eschericha（属名）coli（种名）R（质粒）大肠杆菌R质粒—EcoRIEcoRVHaemophilus（属名）influenzae（种名）d（株名）嗜血流感杆菌d株--HindIIHindIII。罗马数字表达同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶。特殊性质的II型限制酶：同裂酶，同尾酶同裂酶：又称异源同序酶或异源同工酶，是指辨认位点与切割位点均相同的不同来源的酶辨认相同序列，如HindIII–HsuI:A/AGCTT同尾酶：是指辨认位点不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同的末端序列的一类酶，如BglII：A/GATCT；BamHI:G/GATCC。同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的辨认序列均被破坏。2.DNA连接酶（T4-DNA连接酶）功能：体外连接ＤＮＡ片段常用的连接酶：Ｔ４ＤＮＡ连接酶参与连接反映的基团：３端羟基和５端磷酸基团，形成磷酸二酯键DNA连接酶的基本性质：修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键、修复RNA-DNA杂合分子中DNA链上缺口处的磷酸二酯键、连接多个平头双链DNA分子T4DNA连接酶的活性单位定义：在20μl反映体系中于16℃，使HindⅢ切过的lDNA（300μg/ml，0.12μM5'末端）在30分钟内连接50%所需的